Введение
Вы когда-нибудь задумывались, как проточная цитометрия позволяет достичь такого точного и надежного анализа клеток? Ключом к точным результатам является правильная фиксация клеток. Проточная цитометрия позволяет исследователям изучать различные клеточные характеристики, от размера до интенсивности флуоресценции. Однако без надлежащей фиксации данные могут не отражать истинные свойства клеток. В этой статье мы рассмотрим важность фиксации клеток в проточной цитометрии, обсудим различные методы фиксации и поделимся советами для получения оптимальных результатов.
Что такое фиксация клеток в проточной цитометрии?
Определение фиксации клеток
Фиксация клеток — это процесс, который стабилизирует и сохраняет клетки, предотвращая изменения в их структуре, функциях и молекулярном составе. Этот процесс достигается за счет химического сшивания белков, липидов и других клеточных компонентов, эффективно «замораживая» клетки в их текущем состоянии. Это особенно важно при проточной цитометрии, поскольку предотвращает деградацию клеточных маркеров или изменение клеточных структур во время анализа. Фиксируя клетки, исследователи могут гарантировать, что характеристики клеток остаются постоянными, что позволяет проводить точные измерения и получать надежные данные во время анализа проточной цитометрии.
Почему фиксация важна
Правильная фиксация имеет важное значение, поскольку она поддерживает целостность клеточных белков и нуклеиновых кислот, которые имеют решающее значение для точного анализа проточной цитометрии. Если клетки не фиксированы, их структура и молекулярные маркеры могут со временем деградировать или изменяться, что приводит к ненадежным и неточным результатам. Фиксация также играет решающую роль в стабилизации клеток для многопараметрического анализа, что является одним из ключевых преимуществ проточной цитометрии. Это позволяет исследователям одновременно оценивать несколько особенностей клеток, таких как поверхностные маркеры, внутриклеточные белки и содержание ДНК, в одном эксперименте. Без надлежащей фиксации полученные данные могут оказаться противоречивыми или неполными, что приведет к неправильной интерпретации результатов эксперимента.
Типы методов фиксации для проточной цитометрии
Фиксация параформальдегидом (PFA)
Параформальдегид (ПФА) — один из наиболее широко используемых фиксаторов в проточной цитометрии, прежде всего благодаря его эффективности в сохранении морфологии и антигенности клеток. Он работает путем перекрестного связывания белков внутри клеток, гарантируя, что как клеточная структура, так и поверхностные белки остаются нетронутыми. Это делает PFA отличным выбором для сохранения маркеров клеточной поверхности, особенно при анализе экспрессии поверхностных белков в экспериментах по иммунофенотипированию.
Рекомендация:
● Концентрация: для оптимальной фиксации обычно используется 2–4% PFA.
● Время фиксации: Клетки следует инкубировать в PFA в течение 15–30 минут при температуре 2–8°C.
● Хранение: После фиксации клетки следует хранить при температуре 2–8°C для кратковременного хранения. Важно не хранить фиксированные клетки в течение длительного времени, так как это может привести к потере целостности маркера.
Важно избегать чрезмерной фиксации, поскольку длительное воздействие PFA может привести к клеточной автофлуоресценции и помешать последующему окрашиванию и анализу. Всегда используйте минимально необходимое количество времени для фиксации.
Фиксация этанола
Фиксация этанолом обычно используется, когда основное внимание уделяется содержанию ДНК, например, при исследованиях клеточного цикла. Этанол — дегидратирующий агент, который проникает через клеточную мембрану и сохраняет ДНК внутри клеток. Это делает фиксацию этанола особенно полезной для анализов на основе ДНК и анализов проточной цитометрии, где исследуются стадии клеточного цикла или содержание ДНК.
Рекомендация:
● Концентрация: Обычно используется 70-100% этанол.
● Время фиксации. Для достижения оптимальных результатов для фиксации этанолом обычно требуется 10–15 минут.
Фиксация этанолом идеально подходит для сохранения фаз клеточного цикла и может использоваться в сочетании с ДНК-связывающими красителями, такими как йодид пропидия (PI), для анализа клеточного цикла.
Фиксация метанола
Метанол — еще один широко используемый фиксатор, особенно для внутриклеточных анализов. Он действует, проникая через клеточную мембрану и стабилизируя внутренние структуры клетки. Хотя метанол эффективен для сохранения клеточных белков и антигенов, он может вызывать сокращение клеток, что может повлиять на интерпретацию определенных характеристик, таких как размер и морфология клеток.
Рекомендация:
● Концентрация: Обычно используется 90-100% метанола.
● Время фиксации: обычно достаточно 10–15 минут.
Фиксация метанола часто используется при изучении внутриклеточных белков, особенно при исследовании маркеров внутри цитоплазмы или ядра. Однако исследователи должны учитывать возможность сжатия клеток при использовании фиксации метанолом.
Другие фиксаторы (например, формалин)
Формалин, раствор формальдегида в воде, является еще одним фиксатором, используемым в проточной цитометрии, хотя он менее распространен, чем PFA. Формалин широко используется в гистологии и иммуногистохимии, где он эффективно сохраняет образцы тканей для микроскопического анализа. Хотя формалин может сохранять клеточные структуры, его обычно не рекомендуется использовать для проточной цитометрии, если только он не работает с фиксированными образцами тканей, поскольку он может мешать сортировке клеток и некоторым применениям флуоресценции. Фиксация формалином лучше всего подходит для образцов тканей, а не для отдельных клеток.
фиксатор |
Концентрация |
Время фиксации |
Рекомендуемое использование |
Параформальдегид (PFA) |
2-4% |
15-30 минут |
Идеально подходит для сохранения маркеров клеточной поверхности; общий для иммунофенотипирования |
Этанол |
70-100% |
10-15 минут |
Лучше всего подходит для анализа содержания ДНК и изучения клеточного цикла. |
Метанол |
90-100% |
10-15 минут |
Подходит для анализа внутриклеточных белков; может вызвать усадку клеток |
Формалин |
10% (формальдегид) |
Варьируется (зависит от ткани) |
Обычно используется для фиксированных образцов тканей, а не для отдельных клеток. |
Пошаговое руководство по фиксации клеток для проточной цитометрии
Подготовка образца клеток
Перед фиксацией важно изолировать клетки из образца ткани или крови. Центрифугирование является наиболее распространенным методом концентрации клеток в суспензии. Также очень важно тщательно промыть клетки, чтобы удалить любую культуральную среду или остаточные загрязнения, которые могут помешать процессу фиксации.
1. Выделение клеток: используйте стандартные методы выделения, такие как центрифугирование или сортировка клеток, чтобы отделить интересующие клетки.
2. Промывание: Промойте клетки фосфатно-солевым буфером (PBS), чтобы удалить остатки среды и загрязнения, которые могут повлиять на процесс фиксации.
Процедура фиксации
После подготовки клеток следующим шагом является добавление фиксатора в клеточную суспензию. Наиболее часто используемым фиксатором для проточной цитометрии является 2-4% раствор PFA.
1. Добавьте фиксатор в клеточную суспензию, убедившись, что она хорошо перемешана.
2. Инкубируйте клетки с фиксатором 15–30 минут при температуре 2–8°С.
3. После инкубации дважды промойте клетки PBS, чтобы удалить излишки фиксатора.
Шаги после фиксации
После фиксации с клетками необходимо обращаться осторожно. Если необходим дальнейший анализ, клетки следует окрасить перед анализом. Если вы планируете хранить клетки для будущего анализа, ресуспендируйте их в соответствующем буфере и храните при температуре 2–8°C. Не оставляйте клетки в фиксаторе на длительное время, так как чрезмерная фиксация может привести к усилению автофлуоресценции и снижению качества сигнала.
Советы по оптимальной фиксации при проточной цитометрии
Как избежать чрезмерной фиксации
Чрезмерная фиксация возникает, когда клетки слишком долго подвергаются воздействию фиксатора, что может привести к чрезмерному сшиванию клеточных белков и поставить под угрозу качество данных. Это может привести к аутофлуоресценции, снижению связывания антител и неточности измерений проточной цитометрии. Всегда проверяйте рекомендуемое время фиксации для вашего конкретного типа клеток и экспериментируйте, чтобы избежать чрезмерной фиксации.
Время фиксации в зависимости от типа образца
Оптимальное время фиксации может варьироваться в зависимости от типа клеток и характера эксперимента. Например, иммунным клеткам может потребоваться более короткое время фиксации, чем образцам тканей. Отрегулируйте время фиксации в зависимости от конкретных потребностей типа образца. Для анализа поверхностных белков обычно достаточно более короткого времени фиксации (10-15 минут). Для внутриклеточного окрашивания или анализа ДНК может потребоваться более длительное время фиксации.
Окрашивание после фиксации
После фиксации клеток окрашивание антителами или флуоресцентными красителями является важным шагом в анализе проточной цитометрии. Некоторые флуоресцентные красители, особенно тандемные красители, могут быть чувствительны к фиксации и могут разрушаться, если клетки чрезмерно зафиксированы. Для получения оптимальных результатов окрашивания рекомендуется, если это возможно, окрашивать клетки перед фиксацией. Это может помочь предотвратить деградацию красителя и обеспечить более сильные сигналы флуоресценции.
Хранение фиксированных клеток для проточной цитометрии
Кратковременное хранение
Для кратковременного хранения фиксированные клетки можно хранить в холодильнике при температуре 2–8°С. Это идеально, если вы планируете анализировать клетки в течение дня или двух после фиксации. Всегда храните фиксированные клетки в темноте, чтобы предотвратить фотообесцвечивание, которое может повлиять на флуоресцентные сигналы.
Долгосрочное хранение
Для длительного хранения клетки можно заморозить в средах криоконсервации. Типичная среда для криоконсервации состоит из 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и 90% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Однако также доступны бессывороточные растворы для криоконсервации, такие как mFreSR™ или CryoStor™ CS10, которые можно использовать, чтобы избежать проблем, связанных с FBS. Чтобы предотвратить образование кристаллов льда, используйте морозильную камеру с регулируемой скоростью для заморозки клеток. Это помогает поддерживать жизнеспособность клеток и обеспечивает правильное хранение.
Распространенные ошибки, которых следует избегать при фиксации клеток для проточной цитометрии
Последствия неправильной фиксации
Неправильная фиксация может привести к ряду проблем, включая аутофлуоресценцию, снижение связывания антител и плохую жизнеспособность клеток. Эти проблемы могут существенно повлиять на точность и надежность результатов проточной цитометрии. Всегда проверяйте протоколы фиксации для вашего конкретного типа образца и убедитесь, что условия фиксации подходят для типа клеток и анализируемых маркеров.
Выбор подходящего фиксатора для вашего применения
Выбор подходящего фиксатора для эксперимента по проточной цитометрии имеет решающее значение для получения надежных и точных результатов. Различные фиксаторы лучше подходят для разных целей. Например, PFA обычно используется для анализа поверхностных белков, а этанол идеально подходит для исследований на основе ДНК. Прежде чем начать эксперимент, найдите лучший фиксатор для вашего конкретного применения и соответствующим образом скорректируйте протокол фиксации.
Заключение
Правильная фиксация клеток имеет важное значение для достижения успешного анализа проточной цитометрии. Он помогает сохранить клеточные структуры и обеспечивает целостность белков и ДНК. Соблюдая правильные протоколы фиксации и избегая чрезмерной фиксации, исследователи могут повысить точность и надежность данных. Выбор подходящего фиксатора для вашего эксперимента улучшит общее качество ваших результатов. Внедрение этих передовых методов гарантирует, что ваш анализ проточной цитометрии предоставит последовательную и воспроизводимую информацию о клеточных функциях.
Правильная фиксация клеток играет ключевую роль в проточной цитометрии, а продукты HKeybio предлагает надежные решения. Их предложения гарантируют высококачественные результаты и пользуются доверием исследователей во всем мире в плане точного анализа клеток.
Часто задаваемые вопросы
Вопрос: Какова важность фиксации клеток в проточной цитометрии?
Ответ: Фиксация клеток имеет решающее значение в проточной цитометрии, поскольку она сохраняет клеточные структуры и обеспечивает целостность белков и ДНК для точного анализа.
Вопрос: Как долго следует фиксировать клетки для проточной цитометрии?
Ответ: Для поддержания целостности клеток клетки обычно следует фиксировать на 15–30 минут 2–4% раствором параформальдегида (PFA).
Вопрос: Могу ли я использовать этанол для фиксации клеток при проточной цитометрии?
Ответ: Да, фиксация этанолом обычно используется для анализа содержания ДНК в проточной цитометрии, особенно для исследований клеточного цикла.
Вопрос: Что произойдет, если клетки будут чрезмерно зафиксированы при проточной цитометрии?
Ответ: Чрезмерная фиксация может вызвать чрезмерное сшивание, что приведет к аутофлуоресценции и плохому связыванию антител, что может повлиять на результаты проточной цитометрии.
