Введение
Вы когда-нибудь задумывались, как исследователи анализируют тысячи клеток всего за несколько минут? Проточная цитометрия делает это возможным. Этот метод предлагает быстрый многомерный анализ отдельных клеток, раскрывая важную информацию об их физических и химических свойствах.
В этой статье мы рассмотрим внутреннюю работу проточной цитометрии, от подготовки проб до окончательного анализа данных. Вы получите более глубокое понимание того, как этот мощный инструмент изменил научные исследования и клинические применения в таких областях, как иммунология, исследования рака и т. д.
Основные принципы проточной цитометрии
Гидравлическая система
Проточная цитометрия начинается с жидкостной системы, где образец, содержащий клетки или частицы, суспендируется в жидком растворе и вводится в проточный цитометр. В системе используется защитная жидкость, которая окружает образец и обеспечивает выравнивание клеток в один файл. Это гарантирует, что клетки анализируются одна за другой, когда они проходят через лазерный луч. Система флюидики отвечает за точное движение и организацию клеток внутри прибора, что имеет решающее значение для обеспечения точных измерений в процессе анализа. Без хорошо функционирующей системы флюидики было бы невозможно поддерживать высокую точность и скорость, которыми славится проточная цитометрия. Способность системы объединять ячейки в поток одного файла позволяет проводить подробный анализ отдельных ячеек, что важно для понимания поведения и характеристик отдельных ячеек.
Рассеяние света и флуоресценция
Следующий ключевой принцип проточной цитометрии касается взаимодействия клеток со светом. Прямое рассеяние (FSC) измеряет размер ячейки, а боковое рассеяние (SSC) измеряет внутреннюю сложность, такую как степень детализации или структуру ячейки. Вместе эти два параметра рассеяния предоставляют фундаментальную информацию о физической структуре клетки.
Кроме того, флуоресценция играет решающую роль в идентификации специфических маркеров или молекул внутри клеток. Когда клетки помечены флуоресцентными метками, они излучают свет разной длины волны при воздействии лазеров. Это излучение флуоресценции предоставляет подробную информацию о присутствии определенных белков, нуклеиновых кислот или других молекул внутри клетки. Комбинация рассеяния света и флуоресценции позволяет проводить многомерный анализ клеток, позволяя исследователям глубже понять их свойства.
Детекторы и обработка сигналов
Когда клетки проходят через лазер, рассеяние света и флуоресцентные сигналы обнаруживаются сложными детекторами, такими как фотодиоды или фотоумножители. Эти детекторы улавливают излучаемые сигналы и преобразуют их в цифровые данные. Эти данные затем обрабатываются компьютером, что позволяет исследователям анализировать и интерпретировать характеристики клеток. Полученные данные можно визуализировать в различных форматах, таких как гистограммы, точечные диаграммы или более сложные методы, в зависимости от сложности эксперимента.
Точность и чувствительность детекторов необходимы для обеспечения того, чтобы собранные данные отражали истинные свойства анализируемых клеток. С развитием технологии детекторов проточная цитометрия стала еще более мощной, позволяя одновременно обнаруживать несколько параметров, что еще больше расширяет возможности метода.
Параметр |
Измерение |
Цель |
Прямое рассеяние (FSC) |
Свет рассеивается в прямом направлении |
Измеряет размер ячейки |
Боковое рассеяние (SSC) |
Свет рассеивается под углом 90° |
Измеряет внутреннюю сложность или степень детализации |
флуоресценция |
Свет, излучаемый флуорофорами |
Обнаруживает специфические маркеры или белки внутри/вне клеток |
Роль лазеров в проточной цитометрии
Типы и функции лазеров
В проточной цитометрии лазеры необходимы для возбуждения флуоресцентных маркеров, прикрепленных к клеткам. Современные проточные цитометры обычно используют несколько лазеров для возбуждения различных флуорофоров. Каждый лазер настроен на определенную длину волны, которая активирует флуоресцентные красители или белки, прикрепленные к клеткам. Возможность использования нескольких лазеров позволяет проводить комплексный анализ множества параметров одной клетки, что делает проточную цитометрию бесценным инструментом для сложных экспериментов. Использование лазеров в проточной цитометрии позволяет исследователям выполнять высокопроизводительный анализ тысяч клеток одновременно. Лазеры не только возбуждают флуоресцентные маркеры, но и обеспечивают свет, необходимый для измерения размера клеток и их внутренней сложности за счет рассеяния света. Это делает лазеры краеугольным камнем техники.
Тип лазера |
Длина волны |
Функция |
Возбужденные флуорофоры |
Синий лазер |
488 нм |
Возбуждает зеленые флуорофоры |
ФИТЦ, ГФП |
Красный лазер |
633 нм |
Возбуждает дальнекрасные флуорофоры |
APC, Алекса Флюор 647 |
Фиолетовый лазер |
405 нм |
Возбуждает фиолетовые и УФ-флуорофоры. |
DAPI, Тихоокеанский синий |
Лазерное взаимодействие с клетками
Когда клетки проходят через лазерный луч, происходит рассеяние света в разных направлениях. Прямое рассеяние измеряет количество света, рассеянного в направлении лазерного луча, предоставляя информацию о размере клетки. Боковое рассеяние, измеряемое под углом 90 градусов к лазеру, измеряет количество света, рассеянного внутренними структурами клетки, позволяя лучше понять ее внутреннюю сложность. Помимо рассеяния, флуоресцентные маркеры, прикрепленные к клеткам, излучают свет определенных длин волн при возбуждении лазером. Этот излучаемый свет улавливается детекторами и используется для измерения присутствия определенных маркеров или белков на поверхности клетки или внутри самой клетки. Сочетание рассеяния света и флуоресценции позволяет проводить столь детальный анализ клеток с помощью проточной цитометрии.
Подготовка проб для проточной цитометрии
Маркировка клеток флуоресцентными красителями
Для анализа проточной цитометрии клетки необходимо сначала пометить флуоресцентными красителями или антителами. Эти метки связываются со специфическими белками или маркерами на поверхности или внутри клетки, что позволяет их обнаруживать и измерять в процессе анализа. Общие маркеры, используемые в проточной цитометрии, включают ДНК-связывающие красители, которые могут оценивать жизнеспособность и здоровье клеток, а также флуоресцентно конъюгированные антитела, которые нацелены на определенные белки на поверхности клетки. Процесс маркировки клеток гарантирует, что проточный цитометр может идентифицировать интересующие маркеры, предоставляя важную информацию о характеристиках клетки. Например, исследователи могут пометить иммунные клетки антителами против конкретных поверхностных маркеров, чтобы проанализировать иммунные реакции или прогрессирование заболевания.
Гидродинамическая фокусировка
Важным этапом в проточной цитометрии является гидродинамическая фокусировка, при которой система струйной техники превращает клеточную суспензию в узкий поток, гарантируя, что клетки проходят через лазер одна за другой. Этот метод гарантирует, что каждая ячейка анализируется индивидуально, что имеет решающее значение для получения точных данных. Гидродинамическая фокусировка позволяет разделить клетки в образце, поэтому их можно анализировать без вмешательства со стороны соседних клеток. Гидродинамическая фокусировка является одним из ключевых факторов, которые отличают проточную цитометрию от других методов, таких как микроскопия, которые могут быть не в состоянии анализировать большие популяции клеток так же быстро и эффективно.
Сбор и анализ данных
Стробирование и визуализация данных
После сбора данных с проточного цитометра для фильтрации и визуализации конкретных популяций клеток используются методы гейтирования. Для отображения данных обычно используются традиционные методы, такие как гистограммы и точечные графики. Эти визуализации позволяют исследователям группировать клетки на основе таких характеристик, как размер, степень детализации и флуоресценция. Новые методы, такие как PCA (анализ главных компонентов), SPADE (анализ прогрессии связующего дерева событий, нормализованных по плотности) и tSNE (t-распределенное стохастическое встраивание соседей), используются для анализа сложных наборов данных со многими параметрами. Эти передовые алгоритмы позволяют исследователям выявлять тонкие закономерности в больших наборах данных и извлекать значимую биологическую информацию.
Многопараметрический анализ
Одной из самых сильных сторон проточной цитометрии является ее способность измерять несколько параметров одновременно. Эта возможность позволяет проводить подробный анализ клеток, например, измерять их размер, экспрессию белка и жизнеспособность в одном эксперименте. Проточная цитометрия может измерять до 30 параметров на клетку, что делает ее идеальной для изучения сложных популяций клеток, например, обнаруженных при раке или иммунных реакциях. Многопараметрический анализ необходим для изучения гетерогенных популяций, где клетки могут различаться по многим аспектам. Эта способность одновременно измерять несколько характеристик одной клетки дает исследователям более полную картину изучаемой популяции клеток.
Применение проточной цитометрии
Иммунофенотипирование
Одним из наиболее распространенных применений проточной цитометрии является иммунофенотипирование, которое включает анализ иммунных клеток на основе их поверхностных маркеров. Проточная цитометрия может одновременно измерять несколько различных маркеров на иммунных клетках, что позволяет исследователям классифицировать типы клеток, выявлять иммунные реакции и отслеживать прогрессирование заболевания. Оно широко используется при диагностике иммунодефицитов, лейкемии, лимфомы и других состояний, связанных с иммунитетом. Иммунофенотипирование стало важным инструментом в исследованиях и клинической практике для понимания функции иммунной системы и выявления клеточных аномалий.
Исследования рака
Проточная цитометрия играет решающую роль в исследованиях рака, особенно в понимании биологии раковых клеток. Это позволяет исследователям изучать содержание ДНК клеток, обнаруживать опухолевые маркеры и измерять скорость пролиферации клеток. Используя проточную цитометрию, ученые могут отслеживать, как раковые клетки реагируют на лечение, оценивать агрессивность опухолей и определять новые терапевтические цели. Этот метод незаменим при изучении гематологических видов рака, таких как лейкемия и лимфома, а также при исследованиях солидных опухолей, предоставляя информацию, которая может помочь в принятии решений о лечении.
Микробные и гематологические исследования
Помимо изучения клеток человека, проточная цитометрия также широко используется в микробных исследованиях для изучения бактерий, вирусов и других патогенов. Он может идентифицировать микробы на основе их уникальных свойств, таких как размер, форма и экспрессия белка. В гематологии проточная цитометрия используется для изучения клеток крови, выявления отклонений в показателях крови и диагностики таких заболеваний, как анемия и лейкемия.
Приложение |
Поле |
Цель |
Иммунофенотипирование |
Иммунология |
Классификация иммунных клеток, диагностика иммунных заболеваний |
Исследования рака |
онкология |
Изучение биологии раковых клеток, выявление опухолевых маркеров, мониторинг реакции на лечение |
Микробный анализ |
Микробиология |
Идентификация и анализ патогенов на основе физических свойств |
Гематология |
Гематология |
Изучение популяций клеток крови, диагностика заболеваний крови. |
Будущее проточной цитометрии
Достижения в области технологий
Область проточной цитометрии быстро развивается, и новые технологии расширяют ее возможности. Системы с высокой пропускной способностью позволяют анализировать тысячи клеток за считанные секунды, а конфигурации с несколькими лазерами увеличивают количество обнаруживаемых параметров, улучшая объем и детализацию экспериментов. Интеграция визуализационной проточной цитометрии, которая сочетает в себе традиционную проточную цитометрию с микроскопией, позволяет исследователям получать подробные изображения клеток вместе с многопараметрическими данными. Эти технологические достижения делают проточную цитометрию еще более мощной, позволяя исследователям выполнять более сложные анализы и получать более глубокое понимание клеточной биологии.
Расширение приложений
По мере развития проточной цитометрии ее применение расширяется и охватывает новые области, такие как персонализированная медицина, иммунотерапия и обнаружение редких клеток. Возможность анализировать широкий спектр клеточных маркеров и свойств делает проточную цитометрию незаменимым инструментом для исследователей во многих областях: от лечения рака до мониторинга инфекционных заболеваний.
Заключение
Проточная цитометрия — жизненно важный инструмент в современных биологических исследованиях, позволяющий получить представление о свойствах и поведении отдельных клеток с беспрецедентной скоростью. От исследований рака до иммунологии – его применения обширны и разнообразны. По мере развития технологий точность и возможности применения этого метода продолжают расти, что делает его ключевым активом в научных и медицинских исследованиях. Благодаря быстрому развитию проточная цитометрия, несомненно, останется на переднем крае биологических открытий и клинической диагностики.
Для таких компаний, как HKeybio , предлагающая передовые решения для проточной цитометрии, эта технология может предоставить ценную информацию о поведении клеток и оптимизировать исследовательские усилия. Их продукция обладает уникальными преимуществами, внося значительный вклад в быстрый прогресс в биологических и клинических исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Вопрос: Что такое проточная цитометрия?
Ответ: Проточная цитометрия — это метод, используемый для анализа и измерения физических и химических свойств клеток. Он работает путем суспендирования клеток в потоке жидкости, пропускания их через лазеры и измерения рассеяния света и флуоресценции.
Вопрос: Как работает проточная цитометрия?
Ответ: Проточная цитометрия использует лазеры для индивидуального анализа клеток на основе их размера, внутренней сложности и флуоресцентных маркеров. Обнаруженные сигналы преобразуются в данные для анализа.
Вопрос: Каковы основные области применения проточной цитометрии?
Ответ: Проточная цитометрия используется в иммунологии, исследованиях рака, микробиологии и гематологии для анализа и сортировки клеток по различным характеристикам.
Вопрос: Почему проточная цитометрия важна в исследованиях?
Ответ: Проточная цитометрия обеспечивает высокоскоростные многопараметрические данные, позволяющие быстро анализировать большие популяции клеток, что имеет решающее значение для научных и медицинских исследований.
Вопрос: Насколько точна проточная цитометрия?
Ответ: Проточная цитометрия отличается высокой точностью, поскольку позволяет быстро и точно измерять множество параметров отдельных клеток, предоставляя надежные данные для исследований и диагностики.
