Úvod
Premýšľali ste niekedy ako prietoková cytometria dosahuje takú presnú a spoľahlivú analýzu buniek? Kľúčom k presným výsledkom je správna fixácia buniek. Prietoková cytometria umožňuje výskumníkom študovať rôzne bunkové charakteristiky, od veľkosti až po intenzitu fluorescencie. Bez správnej fixácie však údaje nemusia odrážať skutočné bunkové vlastnosti. V tomto článku budeme skúmať dôležitosť fixácie buniek v prietokovej cytometrii, diskutovať o rôznych metódach fixácie a zdieľať tipy na dosiahnutie optimálnych výsledkov.
Čo je fixácia buniek v prietokovej cytometrii?
Definícia fixácie buniek
Fixácia buniek je proces, ktorý stabilizuje a chráni bunky tým, že bráni zmenám v ich štruktúre, funkcii a molekulárnom zložení. Tento proces sa dosahuje chemickým zosieťovaním proteínov, lipidov a iných bunkových zložiek, čím sa bunky efektívne 'zmrazia' v ich aktuálnom stave. Toto je obzvlášť dôležité pri prietokovej cytometrii, pretože to zabraňuje degradácii bunkových markerov alebo zmene bunkových štruktúr počas analýzy. Fixáciou buniek môžu výskumníci zabezpečiť, aby charakteristiky buniek zostali konzistentné, čo umožňuje presné merania a spoľahlivé údaje počas analýzy prietokovej cytometrie.
Prečo je fixácia dôležitá
Správna fixácia je nevyhnutná, pretože zachováva integritu bunkových proteínov a nukleových kyselín, ktoré sú kľúčové pre presnú analýzu prietokovou cytometriou. Ak bunky nie sú fixované, ich štruktúra a molekulárne markery sa môžu časom degradovať alebo meniť, čo vedie k nespoľahlivým a nepresným výsledkom. Fixácia tiež zohráva rozhodujúcu úlohu pri stabilizácii buniek pre multiparametrovú analýzu, čo je jedna z kľúčových silných stránok prietokovej cytometrie. Umožňuje výskumníkom súčasne posúdiť viaceré bunkové vlastnosti, ako sú povrchové markery, intracelulárne proteíny a obsah DNA, v jednom experimente. Bez správnej fixácie môžu byť získané údaje nekonzistentné alebo neúplné, čo vedie k nesprávnej interpretácii experimentálnych výsledkov.
Typy fixačných metód pre prietokovú cytometriu
Fixácia paraformaldehydom (PFA).
Paraformaldehyd (PFA) je jedným z najpoužívanejších fixatív v prietokovej cytometrii, predovšetkým kvôli jeho účinnosti pri zachovaní morfológie a antigenicity buniek. Funguje tak, že zosieťuje proteíny v bunkách, čím zaistí, že bunková štruktúra aj povrchové proteíny zostanú nedotknuté. Vďaka tomu je PFA vynikajúcou voľbou na zachovanie markerov bunkového povrchu, najmä pri analýze expresie povrchových proteínov v experimentoch imunofenotypizácie.
Odporúčanie:
● Koncentrácia: Na optimálnu fixáciu sa bežne používa 2-4% PFA.
● Čas fixácie: Bunky by sa mali inkubovať v PFA 15-30 minút pri 2-8°C.
● Skladovanie: Po fixácii by sa bunky mali skladovať pri teplote 2 – 8 °C na krátkodobé skladovanie. Je dôležité neskladovať fixované bunky dlhší čas, pretože to môže viesť k strate integrity markera.
Je dôležité vyhnúť sa nadmernej fixácii, pretože dlhodobé vystavenie PFA môže viesť k bunkovej autofluorescencii a interferovať s následným farbením a analýzou. Na fixáciu vždy použite minimálny požadovaný čas.
Fixácia etanolom
Fixácia etanolu sa bežne používa, keď sa analýza zameriava na obsah DNA, ako napríklad pri štúdiách bunkového cyklu. Etanol je dehydratačné činidlo, ktoré funguje tak, že preniká cez bunkovú membránu a zachováva DNA v bunkách. Vďaka tomu je fixácia etanolu obzvlášť užitočná pre testy založené na DNA a analýzy prietokovej cytometrie, kde sa skúmajú štádiá bunkového cyklu alebo obsah DNA.
Odporúčanie:
● Koncentrácia: Zvyčajne sa používa 70-100% etanol.
● Čas fixácie: Fixácia etanolom zvyčajne vyžaduje 10-15 minút na dosiahnutie optimálnych výsledkov.
Etanolová fixácia je ideálna na zachovanie fáz bunkového cyklu a môže sa použiť v kombinácii s farbivami viažucimi DNA, ako je propidium jodid (PI) na analýzu bunkového cyklu.
Fixácia metanolom
Metanol je ďalším bežne používaným fixatívom, najmä na intracelulárne analýzy. Funguje tak, že preniká cez bunkovú membránu a stabilizuje vnútorné štruktúry bunky. Zatiaľ čo metanol je účinný pri zachovaní bunkových proteínov a antigénov, môže spôsobiť zmršťovanie buniek, čo môže ovplyvniť interpretáciu určitých znakov, ako je veľkosť a morfológia buniek.
Odporúčanie:
● Koncentrácia: Typicky sa používa 90-100% metanol.
● Doba fixácie: 10-15 minút zvyčajne postačuje.
Fixácia metanolom sa často používa pri štúdiu intracelulárnych proteínov, najmä pri skúmaní markerov vo vnútri cytoplazmy alebo jadra. Vedci by však mali zvážiť možnosť zmršťovania buniek pri použití fixácie metanolom.
Iné fixačné prostriedky (napr. formalín)
Formalín, roztok formaldehydu vo vode, je ďalším fixačným prostriedkom používaným v prietokovej cytometrii, hoci je menej bežný ako PFA. Formalín je široko používaný v histológii a imunohistochémii, kde účinne uchováva vzorky tkaniva na mikroskopickú analýzu. Aj keď formalín môže zachovať bunkové štruktúry, vo všeobecnosti sa neodporúča na prietokovú cytometriu, pokiaľ sa nepracuje s fixovanými vzorkami tkaniva, pretože môže interferovať s triedením buniek a niektorými fluorescenčnými aplikáciami. Formalínová fixácia je najvhodnejšia pre vzorky tkaniva, nie pre jednotlivé bunky.
Fixačný prostriedok |
Koncentrácia |
Čas fixácie |
Odporúčané použitie |
paraformaldehyd (PFA) |
2-4% |
15-30 minút |
Ideálne na zachovanie markerov bunkového povrchu; bežné pre imunofenotypizáciu |
Etanol |
70 – 100 % |
10-15 minút |
Najlepšie pre analýzu obsahu DNA a štúdie bunkového cyklu |
metanol |
90 – 100 % |
10-15 minút |
Vhodné na analýzu intracelulárnych proteínov; môže spôsobiť zmršťovanie buniek |
formalín |
10% (formaldehyd) |
Líši sa (závisí od tkaniva) |
Vo všeobecnosti sa používa pre vzorky fixovaného tkaniva, nie pre jednotlivé bunky |
Podrobný sprievodca fixáciou buniek pre prietokovú cytometriu
Príprava vzorky buniek
Pred fixáciou je nevyhnutné izolovať bunky z tkaniva alebo vzorky krvi. Centrifugácia je najbežnejšou metódou používanou na koncentrovanie buniek v suspenzii. Je tiež dôležité dôkladne umyť bunky, aby sa odstránili všetky kultivačné médiá alebo zvyškové kontaminanty, ktoré by mohli interferovať s procesom fixácie.
1. Izolácia buniek: Na oddelenie požadovaných buniek použite štandardné metódy izolácie, ako je centrifugácia alebo triedenie buniek.
2. Premývanie: Premyte bunky fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS), aby ste odstránili zvyškové médiá a kontaminanty, ktoré by mohli ovplyvniť proces fixácie.
Postup fixácie
Keď sú bunky pripravené, ďalším krokom je pridanie fixačného činidla do bunkovej suspenzie. Najčastejšie používaným fixatívom na prietokovú cytometriu je 2-4% roztok PFA.
1. Pridajte fixačný prostriedok do bunkovej suspenzie a uistite sa, že je dobre premiešaný.
2. Inkubujte bunky s fixatívom 15-30 minút pri 2-8°C.
3. Po inkubácii premyte bunky dvakrát PBS, aby ste odstránili prebytočný fixatív.
Kroky po fixácii
Po fixácii treba s bunkami zaobchádzať opatrne. Ak je potrebná ďalšia analýza, bunky by sa mali pred analýzou zafarbiť. Ak plánujete uchovávať bunky pre budúcu analýzu, resuspendujte ich vo vhodnom pufri a skladujte pri teplote 2 – 8 °C. Nenechávajte bunky vo fixatíve dlhší čas, pretože nadmerná fixácia môže viesť k zvýšenej autofluorescencii a zníženiu kvality signálu.
Tipy pre optimálnu fixáciu v prietokovej cytometrii
Vyhýbanie sa nadmernej fixácii
K nadmernej fixácii dochádza, keď sú bunky vystavené fixačnému prostriedku príliš dlho, čo môže viesť k nadmernému zosieťovaniu bunkových proteínov a ohroziť kvalitu údajov. To môže viesť k autofluorescencii, zníženej väzbe protilátok a nepresným meraniam prietokovej cytometrie. Vždy skontrolujte odporúčané časy fixácie pre váš špecifický typ buniek a experimentujte, aby ste sa vyhli nadmernej fixácii.
Čas fixácie vs. typ vzorky
Optimálny čas fixácie sa môže líšiť v závislosti od typu bunky a povahy experimentu. Napríklad imunitné bunky môžu vyžadovať kratšie časy fixácie ako vzorky tkaniva. Upravte čas fixácie na základe špecifických potrieb typu vzorky. Na analýzu povrchových proteínov zvyčajne postačuje kratší čas fixácie (10-15 minút). Na intracelulárne farbenie alebo analýzu DNA môže byť potrebný dlhší čas fixácie.
Farbenie po fixácii
Po fixácii buniek je farbenie protilátkami alebo fluorescenčnými farbivami kritickým krokom v analýze prietokovej cytometrie. Niektoré fluorescenčné farbivá, najmä tandemové farbivá, môžu byť citlivé na fixáciu a môžu degradovať, ak sú bunky nadmerne fixované. Pre optimálne výsledky farbenia sa odporúča zafarbiť bunky pred fixáciou vždy, keď je to možné. To môže pomôcť zabrániť degradácii farbiva a zabezpečiť silnejšie fluorescenčné signály.
Ukladanie fixných buniek pre prietokovú cytometriu
Krátkodobé skladovanie
Pre krátkodobé skladovanie môžu byť fixované bunky skladované v chladničke pri teplote 2-8°C. To je ideálne, keď plánujete analyzovať bunky do jedného alebo dvoch dní po fixácii. Fixované bunky vždy skladujte v tme, aby ste zabránili vyblednutiu svetlom, ktoré môže ovplyvniť fluorescenčné signály.
Dlhodobé skladovanie
Pre dlhodobé skladovanie môžu byť bunky zmrazené v kryokonzervačných médiách. Typické médium na kryokonzerváciu pozostáva z 10 % dimetylsulfoxidu (DMSO) a 90 % fetálneho bovinného séra (FBS). K dispozícii sú však aj bezsérové kryokonzervačné roztoky ako mFreSR™ alebo CryoStor™ CS10, ktoré možno použiť, aby ste sa vyhli problémom spojeným s FBS. Aby ste zabránili tvorbe ľadových kryštálikov, použite na zmrazenie buniek mrazničku s kontrolovanou rýchlosťou. To pomáha udržiavať životaschopnosť buniek a zabezpečuje správne skladovanie.
Bežné úskalia, ktorým sa treba vyhnúť pri fixácii buniek pre prietokovú cytometriu
Účinky nesprávnej fixácie
Nesprávna fixácia môže viesť k niekoľkým problémom, vrátane autofluorescencie, zníženej väzby protilátok a zlej životaschopnosti buniek. Tieto problémy môžu významne ovplyvniť presnosť a spoľahlivosť výsledkov prietokovej cytometrie. Vždy si overte fixačné protokoly pre váš špecifický typ vzorky a uistite sa, že podmienky fixácie sú vhodné pre typ buniek a analyzované markery.
Výber správneho fixačného prostriedku pre vašu aplikáciu
Výber vhodného fixačného prostriedku pre váš experiment prietokovej cytometrie je rozhodujúci pre získanie spoľahlivých a presných výsledkov. Rôzne fixačné prostriedky sú vhodnejšie pre rôzne aplikácie. Napríklad PFA sa bežne používa na analýzu povrchových proteínov, zatiaľ čo etanol je ideálny pre štúdie založené na DNA. Pred začatím experimentu preskúmajte najlepší fixátor pre vašu špecifickú aplikáciu a podľa toho upravte fixačný protokol.
Záver
Správna fixácia buniek je nevyhnutná na dosiahnutie úspešnej analýzy prietokovou cytometriou. Pomáha zachovať bunkové štruktúry a zabezpečuje integritu proteínov a DNA. Dodržiavaním správnych fixačných protokolov a vyhýbaním sa nadmernej fixácii môžu výskumníci zvýšiť presnosť a spoľahlivosť údajov. Výber vhodného fixačného prostriedku pre váš experiment zlepšuje celkovú kvalitu vašich výsledkov. Implementácia týchto osvedčených postupov zaisťuje, že vaša analýza prietokovou cytometriou poskytuje konzistentné, reprodukovateľné poznatky o bunkových funkciách.
Správna fixácia buniek hrá kľúčovú úlohu v prietokovej cytometrii a produkty z HKeybio ponúka spoľahlivé riešenia. Ich ponuka zaisťuje vysokokvalitné výsledky a výskumníci na celom svete im dôverujú pre presnú analýzu buniek.
FAQ
Otázka: Aký význam má fixácia buniek v prietokovej cytometrii?
Odpoveď: Fixácia buniek je v prietokovej cytometrii kľúčová, pretože zachováva bunkové štruktúry a zabezpečuje integritu proteínov a DNA pre presnú analýzu.
Otázka: Ako dlho by mali byť bunky fixované na prietokovú cytometriu?
Odpoveď: Bunky by sa mali zvyčajne fixovať 15-30 minút 2-4% roztokom paraformaldehydu (PFA), aby sa zachovala bunková integrita.
Otázka: Môžem použiť etanol na fixáciu buniek v prietokovej cytometrii?
Odpoveď: Áno, fixácia etanolu sa bežne používa na analýzu obsahu DNA v prietokovej cytometrii, najmä na štúdie bunkového cyklu.
Otázka: Čo sa stane, ak sú bunky pri prietokovej cytometrii nadmerne fixované?
Odpoveď: Nadmerná fixácia môže spôsobiť nadmerné zosieťovanie, čo vedie k autofluorescencii a slabej väzbe protilátky, čo môže ovplyvniť výsledky prietokovej cytometrie.
