Inleiding
Het jy al ooit gewonder hoe vloeisitometrie sulke presiese en betroubare selanalise bereik? Die sleutel tot akkurate resultate lê in behoorlike selfiksasie. Vloeisitometrie stel navorsers in staat om 'n verskeidenheid sellulêre eienskappe te bestudeer, van grootte tot fluoressensie-intensiteit. Sonder behoorlike fiksasie kan die data egter nie ware sellulêre eienskappe weerspieël nie. In hierdie artikel sal ons die belangrikheid van selfiksasie in vloeisitometrie ondersoek, verskillende fiksasiemetodes bespreek en wenke deel vir optimale resultate.
Wat is selfiksasie in vloeisitometrie?
Definisie van Selfiksasie
Selfiksasie is 'n proses wat die selle stabiliseer en bewaar deur veranderinge in hul struktuur, funksie en molekulêre samestelling te voorkom. Hierdie proses word bereik deur proteïene, lipiede en ander sellulêre komponente chemies te kruisbind, wat die selle effektief in hul huidige toestand 'vries'. Dit is veral belangrik in vloeisitometrie omdat dit die degradasie van sellulêre merkers of die verandering van sellulêre strukture tydens die analise voorkom. Deur die selle vas te maak, kan navorsers verseker dat die eienskappe van die selle konsekwent bly, wat voorsiening maak vir presiese metings en betroubare data tydens vloeisitometrie-analise.
Waarom fiksasie belangrik is
Behoorlike fiksasie is noodsaaklik omdat dit die integriteit van sellulêre proteïene en nukleïensure handhaaf, wat noodsaaklik is vir akkurate vloeisitometrie-analise. As selle nie vas is nie, kan hul struktuur en molekulêre merkers met verloop van tyd afbreek of verander, wat lei tot onbetroubare en onakkurate resultate. Fiksering speel ook 'n kritieke rol in die stabilisering van selle vir multi-parameter analise, wat een van die belangrikste sterk punte van vloeisitometrie is. Dit stel navorsers in staat om gelyktydig veelvuldige selkenmerke, soos oppervlakmerkers, intrasellulêre proteïene en DNA-inhoud, in 'n enkele eksperiment te assesseer. Sonder behoorlike fiksasie kan die data wat verkry word inkonsekwent of onvolledig wees, wat lei tot waninterpretasie van die eksperimentele uitkomste.
Tipes fiksasiemetodes vir vloeisitometrie
Paraformaldehied (PFA) fiksasie
Paraformaldehied (PFA) is een van die mees gebruikte fikseringsmiddels in vloeisitometrie, hoofsaaklik vanweë die doeltreffendheid daarvan in die behoud van selmorfologie en antigenisiteit. Dit werk deur proteïene binne die selle te kruisbind, om te verseker dat beide die sellulêre struktuur en oppervlakproteïene ongeskonde bly. Dit maak PFA 'n uitstekende keuse vir die behoud van seloppervlakmerkers, veral wanneer oppervlakproteïenuitdrukking in immunofenotiperingseksperimente ontleed word.
Aanbeveling:
● Konsentrasie: 2-4% PFA word algemeen gebruik vir optimale fiksasie.
● Fiksasietyd: Selle moet vir 15-30 minute by 2-8°C in PFA geïnkubeer word.
● Berging: Na fiksasie moet selle by 2-8°C gestoor word vir korttermynberging. Dit is belangrik om nie vaste selle vir lang tydperke te stoor nie, aangesien dit tot verlies van merkerintegriteit kan lei.
Dit is belangrik om oorfiksasie te vermy, aangesien langdurige blootstelling aan PFA kan lei tot sellulêre outofluoressensie en inmeng met daaropvolgende kleuring en analise. Gebruik altyd die minimum benodigde tyd vir fiksasie.
Etanol fiksasie
Etanolfiksasie word algemeen gebruik wanneer die fokus van die analise op DNS-inhoud is, soos in selsiklusstudies. Etanol is 'n dehidreermiddel wat werk deur die selmembraan binne te dring en die DNA binne die selle te bewaar. Dit maak etanolfiksasie veral nuttig vir DNS-gebaseerde toetse en vloeisitometrie-ontledings waar selsiklusstadiums of DNS-inhoud ondersoek word.
Aanbeveling:
● Konsentrasie: Tipies word 70-100% etanol gebruik.
● Fikseringstyd: Etanolfiksering vereis tipies 10-15 minute vir optimale resultate.
Etanolfiksasie is ideaal vir die bewaring van selsiklusfases, en dit kan in kombinasie met DNA-bindende kleurstowwe soos propidiumjodied (PI) vir selsiklusanalise gebruik word.
Metanol fiksasie
Metanol is nog 'n algemeen gebruikte fikseermiddel, veral vir intrasellulêre ontledings. Dit werk deur die selmembraan binne te dring en die sel se interne strukture te stabiliseer. Alhoewel metanol effektief is om sellulêre proteïene en antigene te bewaar, kan dit selkrimping veroorsaak, wat die interpretasie van sekere kenmerke kan beïnvloed, soos selgrootte en morfologie.
Aanbeveling:
● Konsentrasie: Tipies word 90-100% metanol gebruik.
● Fiksasietyd: 10-15 minute is gewoonlik voldoende.
Metanolfiksasie word dikwels gebruik wanneer intrasellulêre proteïene bestudeer word, veral wanneer merkers binne die sitoplasma of kern ondersoek word. Navorsers moet egter die potensiaal vir selkrimping oorweeg wanneer metanolfiksasie gebruik word.
Ander fikseringsmiddels (bv. Formalien)
Formalien, 'n oplossing van formaldehied in water, is 'n ander fikseermiddel wat in vloeisitometrie gebruik word, hoewel dit minder algemeen is as PFA. Formalien word wyd gebruik in histologie en immunohistochemie, waar dit weefselmonsters effektief bewaar vir mikroskopiese analise. Alhoewel formalien selstrukture kan bewaar, word dit oor die algemeen nie aanbeveel vir vloeisitometrie nie, tensy daar met vaste weefselmonsters gewerk word, aangesien dit met selsortering en sommige fluoressensietoepassings kan inmeng. Formalienfiksasie is die beste geskik vir weefselmonsters, nie vir individuele selle nie.
Fixatief |
Konsentrasie |
Fiksasie tyd |
Aanbevole gebruik |
Paraformaldehied (PFA) |
2-4% |
15-30 minute |
Ideaal vir die bewaring van seloppervlakmerkers; algemeen vir immunofenotipering |
Etanol |
70-100% |
10-15 minute |
Beste vir DNA-inhoudontleding en selsiklusstudies |
Metanol |
90-100% |
10-15 minute |
Geskik vir intrasellulêre proteïenanalise; kan selkrimping veroorsaak |
Formalien |
10% (formaldehied) |
Varieer (hang af van weefsel) |
Word gewoonlik gebruik vir vaste weefselmonsters, nie vir individuele selle nie |
Stap-vir-stap gids vir die bevestiging van selle vir vloeisitometrie
Voorbereiding van die selmonster
Voor fiksasie is dit noodsaaklik om die selle van die weefsel- of bloedmonster te isoleer. Sentrifugering is die mees algemene metode wat gebruik word om selle in 'n suspensie te konsentreer. Dit is ook van kritieke belang om die selle deeglik te was om enige kultuurmedia of oorblywende kontaminante te verwyder, wat met die fiksasieproses kan inmeng.
1. Selisolasie: Gebruik standaard isolasiemetodes soos sentrifugering of selsortering om die selle van belang te skei.
2. Was: Was die selle met fosfaatgebufferde sout (PBS) om oorblywende media en kontaminante te verwyder wat die fiksasieproses kan beïnvloed.
Bevestigingsprosedure
Sodra die selle voorberei is, is die volgende stap om die fiksasiemiddel by die selsuspensie te voeg. Die mees algemeen gebruikte fixeermiddel vir vloeisitometrie is 'n 2-4% PFA oplossing.
1. Voeg die fiksasiemiddel by die selsuspensie en maak seker dit is goed gemeng.
2. Inkubeer die selle met die fikseermiddel vir 15-30 minute by 2-8°C.
3. Na die inkubasie, was die selle twee keer met PBS om oortollige fiksasiemiddel te verwyder.
Na-fiksasiestappe
Na fiksasie moet die selle versigtig hanteer word. Indien verdere ontleding nodig is, moet selle voor ontleding gekleur word. As jy van plan is om die selle te stoor vir toekomstige ontleding, hersuspendeer hulle in 'n toepaslike buffer en stoor hulle by 2-8°C. Vermy om selle vir lang periodes in die fikseermiddel te laat, aangesien oorfiksasie kan lei tot verhoogde outofluoressensie en verminderde seinkwaliteit.
Wenke vir optimale fiksasie in vloeisitometrie
Vermy oorfiksasie
Oorfiksasie vind plaas wanneer selle te lank aan die fikseermiddel blootgestel word, wat kan lei tot oormatige kruisbinding van sellulêre proteïene en die kwaliteit van die data in gevaar stel. Dit kan lei tot outofluoressensie, verminderde teenliggaambinding en onakkurate vloeisitometriemetings. Kontroleer altyd die aanbevole fiksasietye vir jou spesifieke seltipe en eksperiment om oorfiksering te vermy.
Fiksasietyd vs. Voorbeeldtipe
Die optimale fiksasietyd kan wissel na gelang van die seltipe en die aard van die eksperiment. Immuniteitselle kan byvoorbeeld korter fiksasietye benodig as weefselmonsters. Pas die fiksasietyd aan gebaseer op die spesifieke behoeftes van die monstertipe. Vir oppervlakproteïenanalise is 'n korter fiksasietyd (10-15 minute) gewoonlik voldoende. Vir intrasellulêre kleuring of DNA-analise kan 'n langer fiksasietyd nodig wees.
Verkleuring na fiksering
Nadat die selle vasgemaak is, is kleuring met teenliggaampies of fluoresserende kleurstowwe 'n kritieke stap in vloeisitometrie-analise. Sommige fluoresserende kleurstowwe, veral tandem kleurstowwe, kan sensitief wees vir fiksasie en kan afbreek as die selle oorgefiks is. Vir optimale kleurresultate word dit aanbeveel om die selle te vlek voor fiksasie waar moontlik. Dit kan help om kleurstofdegradasie te voorkom en sterker fluoressensie seine te verseker.
Berging van vaste selle vir vloeisitometrie
Korttermynberging
Vir korttermynberging kan vaste selle by 2-8°C in die yskas gebêre word. Dit is ideaal wanneer jy beplan om die selle binne 'n dag of twee na fiksasie te ontleed. Stoor vaste selle altyd in die donker om fotobleiking te voorkom, wat die fluoresserende seine kan beïnvloed.
Langtermyn berging
Vir langtermynberging kan selle in kriopreserveringsmedia gevries word. 'n Tipiese kriopreserveringsmedium bestaan uit 10% dimetielsulfoksied (DMSO) en 90% fetale beeserum (FBS). Serumvrye kriopreserveringsoplossings soos mFreSR™ of CryoStor™ CS10 is egter ook beskikbaar en kan gebruik word om probleme wat met FBS geassosieer word te vermy. Om yskristalvorming te voorkom, gebruik 'n vrieskas met beheerde snelheid om die selle te vries. Dit help om sellewensvatbaarheid te handhaaf en verseker behoorlike berging.
Algemene slaggate om te vermy in selfiksasie vir vloeisitometrie
Gevolge van onbehoorlike fiksasie
Onbehoorlike fiksasie kan tot verskeie probleme lei, insluitend outofluoressensie, verminderde teenliggaambinding en swak sellewensvatbaarheid. Hierdie probleme kan die akkuraatheid en betroubaarheid van vloeisitometrie-resultate aansienlik beïnvloed. Verifieer altyd fiksasieprotokolle vir jou spesifieke monstertipe, en verseker dat die fiksasietoestande geskik is vir die seltipe en merkers wat ontleed word.
Die keuse van die regte fixeermiddel vir u toepassing
Die keuse van die toepaslike fiksasiemiddel vir jou vloeisitometrie-eksperiment is noodsaaklik vir die verkryging van betroubare en akkurate resultate. Verskillende fikseermiddels is beter geskik vir verskillende toepassings. PFA word byvoorbeeld algemeen gebruik vir oppervlakproteïenanalise, terwyl etanol ideaal is vir DNS-gebaseerde studies.Voor die aanvang van die eksperiment, ondersoek die beste fiksasiemiddel vir jou spesifieke toepassing en pas die fiksasieprotokol dienooreenkomstig aan.
Gevolgtrekking
Behoorlike selfiksasie is noodsaaklik vir die bereiking van suksesvolle vloeisitometrie-analise. Dit help om sellulêre strukture te bewaar en verseker die integriteit van proteïene en DNA. Deur behoorlike fiksasieprotokolle te volg en oorfiksasie te vermy, kan navorsers data akkuraatheid en betroubaarheid verbeter. Die keuse van die toepaslike fixeermiddel vir jou eksperiment verbeter die algehele kwaliteit van jou resultate. Die implementering van hierdie beste praktyke verseker dat jou vloeisitometrie-analise konsekwente, reproduseerbare insigte in sellulêre funksies verskaf.
Behoorlike selfiksasie speel 'n sleutelrol in vloeisitometrie, en produkte van HKeybio bied betroubare oplossings. Hul aanbiedinge verseker hoë gehalte resultate en word deur navorsers wêreldwyd vertrou vir akkurate selanalise.
Gereelde vrae
V: Wat is die belangrikheid van selfiksasie in vloeisitometrie?
A: Selfiksasie is van kardinale belang in vloeisitometrie aangesien dit sellulêre strukture bewaar en die integriteit van proteïene en DNA verseker vir akkurate analise.
V: Hoe lank moet selle vasgestel word vir vloeisitometrie?
A: Selle moet tipies vir 15-30 minute vasgemaak word met 'n 2-4% paraformaldehied (PFA) oplossing om sellulêre integriteit te handhaaf.
V: Kan ek etanol gebruik vir selfiksasie in vloeisitometrie?
A: Ja, etanolfiksasie word algemeen gebruik vir DNA-inhoudontleding in vloeisitometrie, veral vir selsiklusstudies.
V: Wat gebeur as selle oorgefikseerd is in vloeisitometrie?
A: Oorfiksasie kan oormatige kruisbinding veroorsaak, wat lei tot outofluoressensie en swak teenliggaambinding, wat vloeisitometrie-resultate kan beïnvloed.
