Johdanto
Oletko koskaan miettinyt, miten virtaussytometrialla saavutetaan näin tarkka ja luotettava soluanalyysi? Tarkkojen tulosten avain on oikea solukiinnitys. Virtaussytometrian avulla tutkijat voivat tutkia erilaisia solujen ominaisuuksia koosta fluoresenssin intensiteettiin. Ilman asianmukaista kiinnitystä tiedot eivät kuitenkaan välttämättä kuvasta todellisia solun ominaisuuksia. Tässä artikkelissa tutkimme solukiinnityksen merkitystä virtaussytometriassa, keskustelemme erilaisista kiinnitysmenetelmistä ja jaamme vinkkejä optimaalisten tulosten saavuttamiseksi.
Mikä on solujen kiinnitys virtaussytometriassa?
Määritelmä Solun kiinnitys
Solujen kiinnitys on prosessi, joka stabiloi ja säilyttää solut estämällä muutoksia niiden rakenteessa, toiminnassa ja molekyylikoostumuksessa. Tämä prosessi saavutetaan silloittamalla kemiallisesti proteiineja, lipidejä ja muita solukomponentteja 'jäädyttämällä' solut tehokkaasti niiden nykyisessä tilassa. Tämä on erityisen tärkeää virtaussytometriassa, koska se estää solumarkkerien hajoamisen tai solurakenteiden muuttumisen analyysin aikana. Kiinnittämällä solut tutkijat voivat varmistaa, että solujen ominaisuudet pysyvät yhtenäisinä, mikä mahdollistaa tarkat mittaukset ja luotettavat tiedot virtaussytometria-analyysin aikana.
Miksi kiinnitys on tärkeää
Oikea kiinnitys on välttämätöntä, koska se säilyttää solun proteiinien ja nukleiinihappojen eheyden, jotka ovat ratkaisevan tärkeitä tarkan virtaussytometrian analyysin kannalta. Jos soluja ei kiinnitetä, niiden rakenne ja molekyylimarkkerit voivat hajota tai muuttua ajan myötä, mikä johtaa epäluotettaviin ja epätarkkoihin tuloksiin. Fiksaatiolla on myös ratkaiseva rooli solujen stabiloinnissa moniparametrianalyysiä varten, mikä on yksi virtaussytometrian tärkeimmistä vahvuuksista. Sen avulla tutkijat voivat arvioida samanaikaisesti useita solun ominaisuuksia, kuten pintamarkkereita, solunsisäisiä proteiineja ja DNA-pitoisuutta, yhdessä kokeessa. Ilman asianmukaista kiinnitystä saadut tiedot voivat olla epäjohdonmukaisia tai epätäydellisiä, mikä johtaa kokeellisten tulosten väärintulkintaan.
Virtaussytometrian kiinnitysmenetelmien tyypit
Paraformaldehydi (PFA) -kiinnitys
Paraformaldehydi (PFA) on yksi laajimmin käytetyistä kiinnitysaineista virtaussytometriassa, mikä johtuu pääasiassa sen tehokkuudesta säilyttää solumorfologia ja antigeenisyys. Se toimii silloittamalla proteiineja soluissa varmistaen, että sekä solurakenne että pintaproteiinit pysyvät ehjinä. Tämä tekee PFA:sta erinomaisen valinnan solun pintamarkkerien säilyttämiseen, erityisesti analysoitaessa pintaproteiinien ilmentymistä immunofenotyyppikokeissa.
Suositus:
● Pitoisuus: 2-4 % PFA:ta käytetään yleisesti optimaaliseen kiinnitykseen.
● Kiinnitysaika: Soluja tulee inkuboida PFA:ssa 15-30 minuuttia 2-8 °C:ssa.
● Varastointi: Kiinnityksen jälkeen solut tulee säilyttää 2-8°C:ssa lyhytaikaista säilytystä varten. On tärkeää olla säilyttämättä kiinteitä soluja pitkiä aikoja, koska tämä voi johtaa markkerin eheyden menettämiseen.
On tärkeää välttää liiallista kiinnitystä, koska pitkäaikainen altistuminen PFA:lle voi johtaa solujen autofluoresenssiin ja häiritä myöhempää värjäystä ja analysointia. Käytä kiinnitykseen aina mahdollisimman vähän aikaa.
Etanolikiinnitys
Etanolifiksaatiota käytetään yleisesti, kun analyysin painopiste on DNA-sisällössä, kuten solusyklitutkimuksissa. Etanoli on kuivausaine, joka toimii tunkeutumalla solukalvon läpi ja säilyttämällä DNA:n soluissa. Tämä tekee etanolifiksaatiosta erityisen hyödyllisen DNA-pohjaisissa määrityksissä ja virtaussytometrian analyyseissä, joissa tutkitaan solusyklin vaiheita tai DNA-sisältöä.
Suositus:
● Pitoisuus: Tyypillisesti käytetään 70-100 % etanolia.
● Kiinnitysaika: Etanolikiinnitys vaatii yleensä 10-15 minuuttia parhaan tuloksen saavuttamiseksi.
Etanolikiinnitys on ihanteellinen solusyklin vaiheiden säilyttämiseen, ja sitä voidaan käyttää yhdessä DNA:ta sitovien väriaineiden, kuten propidiumjodidin (PI) kanssa solusyklianalyysissä.
Metanolikiinnitys
Metanoli on toinen yleisesti käytetty kiinnitysaine, erityisesti solunsisäisiin analyyseihin. Se toimii tunkeutumalla solukalvon läpi ja stabiloimalla solun sisäisiä rakenteita. Vaikka metanoli säilyttää tehokkaasti solun proteiineja ja antigeenejä, se voi aiheuttaa solujen kutistumista, mikä saattaa vaikuttaa tiettyjen ominaisuuksien, kuten solukoon ja morfologian, tulkintaan.
Suositus:
● Pitoisuus: Tyypillisesti käytetään 90-100 % metanolia.
● Kiinnitysaika: 10-15 minuuttia on yleensä riittävä.
Metanolifiksaatiota käytetään usein tutkittaessa solunsisäisiä proteiineja, erityisesti tutkittaessa markkereita sytoplasman tai tuman sisällä. Tutkijoiden tulisi kuitenkin ottaa huomioon solujen kutistuminen käytettäessä metanolikiinnitystä.
Muut kiinnitysaineet (esim. formaliini)
Formaliini, formaldehydin vesiliuos, on toinen virtaussytometriassa käytettävä kiinnitysaine, vaikka se on vähemmän yleinen kuin PFA. Formaliinia käytetään laajalti histologiassa ja immunohistokemiassa, jossa se säilyttää tehokkaasti kudosnäytteitä mikroskooppista analyysiä varten. Vaikka formaliini voi säilyttää solurakenteita, sitä ei yleensä suositella virtaussytometriaan, ellei sitä käytetä kiinteiden kudosnäytteiden kanssa, koska se voi häiritä solujen lajittelua ja joitain fluoresenssisovelluksia. Formaliinikiinnitys soveltuu parhaiten kudosnäytteille, ei yksittäisille soluille.
Fiksatiivi |
Keskittyminen |
Kiinnitysaika |
Suositeltu käyttö |
Paraformaldehydi (PFA) |
2-4 % |
15-30 minuuttia |
Ihanteellinen solupinnan merkkiaineiden säilyttämiseen; yleinen immunofenotyyppien määrittämisessä |
Etanoli |
70-100 % |
10-15 minuuttia |
Paras DNA-sisältöanalyysiin ja solusyklitutkimuksiin |
Metanoli |
90-100 % |
10-15 minuuttia |
Soveltuu intrasellulaariseen proteiinianalyysiin; voi aiheuttaa solujen kutistumista |
Formaliini |
10 % (formaldehydi) |
Vaihtelee (riippuu kudoksesta) |
Käytetään yleensä kiinteisiin kudosnäytteisiin, ei yksittäisiin soluihin |
Vaiheittainen opas solujen kiinnittämiseen virtaussytometriaa varten
Solunäytteen valmistelu
Ennen kiinnitystä on tärkeää eristää solut kudoksesta tai verinäytteestä. Sentrifugointi on yleisin menetelmä solujen konsentroimiseksi suspensioon. On myös tärkeää pestä solut perusteellisesti, jotta voidaan poistaa kaikki elatusaineet tai jäännöskontaminantit, jotka voivat häiritä kiinnitysprosessia.
1. Solujen eristäminen: Käytä tavallisia eristysmenetelmiä, kuten sentrifugointia tai solujen lajittelua kiinnostavien solujen erottamiseen.
2. Pesu: Pese solut fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) poistaaksesi jäljelle jääneet väliaineet ja epäpuhtaudet, jotka voivat vaikuttaa kiinnitysprosessiin.
Kiinnitysmenettely
Kun solut on valmistettu, seuraava vaihe on lisätä kiinnitysaine solususpensioon. Yleisimmin käytetty kiinnitysaine virtaussytometriassa on 2-4 % PFA-liuos.
1. Lisää kiinnitysaine solususpensioon varmistaen, että se sekoittuu hyvin.
2. Inkuboi soluja kiinnitysaineen kanssa 15-30 minuuttia 2-8°C:ssa.
3. Pese solut inkubaation jälkeen kahdesti PBS:llä ylimääräisen kiinnitysaineen poistamiseksi.
Kiinnityksen jälkeiset vaiheet
Kiinnityksen jälkeen soluja on käsiteltävä varovasti. Jos lisäanalyysiä tarvitaan, solut tulee värjätä ennen analyysiä. Jos aiot säilyttää solut tulevaa analyysiä varten, suspensoi ne uudelleen sopivaan puskuriin ja säilytä 2–8 °C:ssa. Vältä jättämästä soluja kiinnitysaineeseen pitkiä aikoja, koska liiallinen kiinnitys voi johtaa autofluoresenssin lisääntymiseen ja signaalin laadun heikkenemiseen.
Vinkkejä optimaaliseen kiinnitykseen virtaussytometriassa
Ylikiinnityksen välttäminen
Ylifiksaatiota tapahtuu, kun solut altistetaan kiinnitysaineelle liian pitkään, mikä voi johtaa solun proteiinien liialliseen silloittumiseen ja vaarantaa tiedon laadun. Tämä voi johtaa autofluoresenssiin, vähentyneeseen vasta-aineiden sitoutumiseen ja epätarkkoihin virtaussytometrian mittauksiin. Tarkista aina suositellut kiinnitysajat tietylle solutyypille ja kokeile välttääksesi liiallisen kiinnittymisen.
Kiinnitysaika vs. näytteen tyyppi
Optimaalinen kiinnitysaika voi vaihdella solutyypin ja kokeen luonteen mukaan. Esimerkiksi immuunisolut voivat vaatia lyhyempiä kiinnitysaikoja kuin kudosnäytteet. Säädä kiinnitysaika näytetyypin erityistarpeiden mukaan. Pintaproteiinianalyysissä lyhyempi kiinnitysaika (10-15 minuuttia) on yleensä riittävä. Solunsisäistä värjäystä tai DNA-analyysiä varten saatetaan tarvita pidempää kiinnitysaikaa.
Värjäys kiinnityksen jälkeen
Solujen kiinnittämisen jälkeen värjäys vasta-aineilla tai fluoresoivilla väreillä on kriittinen vaihe virtaussytometria-analyysissä. Jotkut fluoresoivat värit, erityisesti tandemvärit, voivat olla herkkiä kiinnittymiselle ja voivat hajota, jos solut kiinnitetään liikaa. Parhaiden värjäystulosten saavuttamiseksi on suositeltavaa värjätä solut ennen kiinnitystä aina kun mahdollista. Tämä voi auttaa estämään värin hajoamista ja varmistamaan vahvemmat fluoresenssisignaalit.
Kiinteiden solujen tallentaminen virtaussytometriaa varten
Lyhytaikainen varastointi
Lyhytaikaista varastointia varten kiinteät solut voidaan säilyttää jääkaapissa 2-8 °C:ssa. Tämä on ihanteellinen, kun aiot analysoida solut vuorokauden tai kahden sisällä kiinnittämisestä. Säilytä kiinteät solut aina pimeässä valovalkaisun estämiseksi, joka voi vaikuttaa fluoresoiviin signaaleihin.
Pitkäaikainen varastointi
Pitkäaikaista varastointia varten solut voidaan pakastaa kylmäsäilytysväliaineissa. Tyypillinen kylmäsäilytysalusta koostuu 10 % dimetyylisulfoksidista (DMSO) ja 90 % fetaalista naudan seerumista (FBS). Saatavilla on kuitenkin myös seerumittomia kryosäilytysratkaisuja, kuten mFreSR™ tai CryoStor™ CS10, ja niitä voidaan käyttää välttämään FBS:ään liittyviä ongelmia. Jääkiteiden muodostumisen estämiseksi solut jäädytetään säädellyllä pakastimella. Tämä auttaa ylläpitämään solujen elinkelpoisuutta ja takaa asianmukaisen varastoinnin.
Yleisiä sudenkuoppia, joita tulee välttää solujen kiinnittämisessä virtaussytometriaa varten
Virheellisen kiinnityksen vaikutukset
Virheellinen kiinnitys voi johtaa useisiin ongelmiin, mukaan lukien autofluoresenssi, vähentynyt vasta-ainesitoutuminen ja huono solujen elinkelpoisuus. Nämä ongelmat voivat vaikuttaa merkittävästi virtaussytometriatulosten tarkkuuteen ja luotettavuuteen. Tarkista aina tietyn näytetyypin kiinnitysprotokollat ja varmista, että kiinnitysolosuhteet ovat sopivat analysoitavalle solutyypille ja markkereihin.
Oikean kiinnitysaineen valitseminen sovellukseesi
Sopivan kiinnitysaineen valitseminen virtaussytometriakokeeseen on ratkaisevan tärkeää luotettavien ja tarkkojen tulosten saamiseksi. Erilaiset kiinnitysaineet sopivat paremmin erilaisiin käyttötarkoituksiin. Esimerkiksi PFA:ta käytetään yleisesti pintaproteiinien analysointiin, kun taas etanoli on ihanteellinen DNA-pohjaisiin tutkimuksiin. Ennen kuin aloitat kokeen, etsi paras kiinnitysaine tiettyyn käyttötarkoitukseen ja säädä kiinnitysprotokollaa sen mukaan.
Johtopäätös
Oikea solukiinnitys on välttämätöntä onnistuneen virtaussytometria-analyysin saavuttamiseksi. Se auttaa säilyttämään solurakenteita ja varmistaa proteiinien ja DNA:n eheyden. Noudattamalla asianmukaisia kiinnitysprotokollia ja välttämällä liiallista kiinnitystä tutkijat voivat parantaa tietojen tarkkuutta ja luotettavuutta. Sopivan kiinnitysaineen valitseminen kokeiluun parantaa tulosten yleistä laatua. Näiden parhaiden käytäntöjen käyttöönotto varmistaa, että virtaussytometriaanalyysisi tarjoaa johdonmukaisia ja toistettavia tietoja solujen toiminnoista.
Oikealla solukiinnityksellä on avainrooli virtaussytometriassa ja niistä saaduissa tuotteissa HKeybio tarjoaa luotettavia ratkaisuja. Heidän tarjontansa takaavat korkealaatuiset tulokset, ja tutkijat maailmanlaajuisesti luottavat niihin tarkassa soluanalyysissä.
FAQ
K: Mikä on solukiinnityksen merkitys virtaussytometriassa?
V: Solujen kiinnittäminen on ratkaisevan tärkeää virtaussytometriassa, koska se säilyttää solurakenteet ja varmistaa proteiinien ja DNA:n eheyden tarkkaa analyysiä varten.
K: Kuinka kauan solut tulee kiinnittää virtaussytometriaa varten?
V: Solut tulee tyypillisesti kiinnittää 15–30 minuuttia 2–4-prosenttisella paraformaldehydiliuoksella (PFA) solujen eheyden säilyttämiseksi.
K: Voinko käyttää etanolia solujen kiinnittämiseen virtaussytometriassa?
V: Kyllä, etanolifiksaatiota käytetään yleisesti DNA-sisältöanalyysiin virtaussytometriassa, erityisesti solusyklitutkimuksissa.
K: Mitä tapahtuu, jos solut ovat liiallisia virtaussytometriassa?
V: Liiallinen kiinnitys voi aiheuttaa liiallista silloitumista, mikä johtaa autofluoresenssiin ja huonoon vasta-aineen sitoutumiseen, mikä voi vaikuttaa virtaussytometrian tuloksiin.
