फ्लो साइटोमेट्री के लिए कोशिकाओं को कैसे ठीक करें

परिचय

क्या आपने कभी सोचा है कैसे फ्लो साइटोमेट्री ऐसे सटीक और विश्वसनीय सेल विश्लेषण को प्राप्त करती है? सटीक परिणामों की कुंजी उचित सेल निर्धारण में निहित है। फ्लो साइटोमेट्री शोधकर्ताओं को आकार से लेकर प्रतिदीप्ति तीव्रता तक विभिन्न सेलुलर विशेषताओं का अध्ययन करने की अनुमति देती है। हालाँकि, उचित निर्धारण के बिना, डेटा वास्तविक सेलुलर गुणों को प्रतिबिंबित नहीं कर सकता है। इस लेख में, हम फ्लो साइटोमेट्री में सेल निर्धारण के महत्व का पता लगाएंगे, विभिन्न निर्धारण विधियों पर चर्चा करेंगे और इष्टतम परिणामों के लिए युक्तियां साझा करेंगे।

 

फ्लो साइटोमेट्री में सेल फिक्सेशन क्या है?

कोशिका निर्धारण की परिभाषा

कोशिका निर्धारण एक ऐसी प्रक्रिया है जो कोशिकाओं की संरचना, कार्य और आणविक संरचना में परिवर्तन को रोककर कोशिकाओं को स्थिर और संरक्षित करती है। यह प्रक्रिया प्रोटीन, लिपिड और अन्य सेलुलर घटकों को रासायनिक रूप से क्रॉस-लिंक करके, कोशिकाओं को उनकी वर्तमान स्थिति में प्रभावी ढंग से 'फ्रीज़' करके प्राप्त की जाती है। यह फ्लो साइटोमेट्री में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि यह विश्लेषण के दौरान सेलुलर मार्करों के क्षरण या सेलुलर संरचनाओं के परिवर्तन को रोकता है। कोशिकाओं को ठीक करके, शोधकर्ता यह सुनिश्चित कर सकते हैं कि कोशिकाओं की विशेषताएं सुसंगत रहें, जो प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के दौरान सटीक माप और विश्वसनीय डेटा की अनुमति देता है।

फिक्सेशन क्यों महत्वपूर्ण है

उचित निर्धारण आवश्यक है क्योंकि यह सेलुलर प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड की अखंडता को बनाए रखता है, जो सटीक प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण हैं। यदि कोशिकाएं स्थिर नहीं हैं, तो उनकी संरचना और आणविक मार्कर समय के साथ खराब हो सकते हैं या बदल सकते हैं, जिससे अविश्वसनीय और गलत परिणाम सामने आ सकते हैं। मल्टी-पैरामीटर विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को स्थिर करने में फिक्सेशन भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो फ्लो साइटोमेट्री की प्रमुख शक्तियों में से एक है। यह शोधकर्ताओं को एक ही प्रयोग में कई कोशिका विशेषताओं, जैसे सतह मार्कर, इंट्रासेल्युलर प्रोटीन और डीएनए सामग्री का एक साथ आकलन करने की अनुमति देता है। उचित निर्धारण के बिना, प्राप्त डेटा असंगत या अधूरा हो सकता है, जिससे प्रयोगात्मक परिणामों की गलत व्याख्या हो सकती है।

 

फ्लो साइटोमेट्री के लिए निर्धारण विधियों के प्रकार

पैराफॉर्मल्डिहाइड (पीएफए) निर्धारण

पैराफॉर्मल्डिहाइड (पीएफए) फ्लो साइटोमेट्री में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले फिक्सेटिव्स में से एक है, मुख्य रूप से सेल आकृति विज्ञान और एंटीजेनेसिटी को संरक्षित करने में इसकी प्रभावशीलता के कारण। यह कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन को क्रॉस-लिंक करके काम करता है, यह सुनिश्चित करता है कि सेलुलर संरचना और सतह प्रोटीन दोनों बरकरार रहें। यह पीएफए ​​को कोशिका सतह मार्करों को संरक्षित करने के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प बनाता है, खासकर जब इम्यूनोफेनोटाइपिंग प्रयोगों में सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करता है।

सिफारिश:

● एकाग्रता: 2-4% पीएफए ​​आमतौर पर इष्टतम निर्धारण के लिए उपयोग किया जाता है।

● निर्धारण समय: कोशिकाओं को पीएफए ​​में 15-30 मिनट के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाना चाहिए।

● भंडारण: निर्धारण के बाद, कोशिकाओं को अल्पकालिक भंडारण के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए। यह महत्वपूर्ण है कि स्थिर कोशिकाओं को लंबे समय तक संग्रहित न किया जाए, क्योंकि इससे मार्कर की अखंडता का नुकसान हो सकता है।

अति-निर्धारण से बचना महत्वपूर्ण है, क्योंकि पीएफए ​​के लंबे समय तक संपर्क में रहने से सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस हो सकता है और बाद के धुंधलापन और विश्लेषण में हस्तक्षेप हो सकता है। निर्धारण के लिए हमेशा न्यूनतम आवश्यक समय का उपयोग करें।

इथेनॉल निर्धारण

इथेनॉल निर्धारण का उपयोग आमतौर पर तब किया जाता है जब विश्लेषण का ध्यान डीएनए सामग्री पर होता है, जैसे कि कोशिका चक्र अध्ययन में। इथेनॉल एक निर्जलीकरण एजेंट है जो कोशिका झिल्ली में प्रवेश करके और कोशिकाओं के भीतर डीएनए को संरक्षित करके काम करता है। यह इथेनॉल निर्धारण को विशेष रूप से डीएनए-आधारित परख और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए उपयोगी बनाता है जहां कोशिका चक्र चरणों या डीएनए सामग्री की जांच की जा रही है।

सिफारिश:

● एकाग्रता: आमतौर पर, 70-100% इथेनॉल का उपयोग किया जाता है।

● निर्धारण समय: इष्टतम परिणामों के लिए इथेनॉल निर्धारण में आमतौर पर 10-15 मिनट की आवश्यकता होती है।

इथेनॉल निर्धारण कोशिका चक्र चरणों को संरक्षित करने के लिए आदर्श है, और इसका उपयोग कोशिका चक्र विश्लेषण के लिए प्रोपीडियम आयोडाइड (पीआई) जैसे डीएनए-बाध्यकारी रंगों के संयोजन में किया जा सकता है।

मेथनॉल निर्धारण

मेथनॉल एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला फिक्सेटिव है, खासकर इंट्रासेल्युलर विश्लेषण के लिए। यह कोशिका झिल्ली में प्रवेश करके और कोशिका की आंतरिक संरचनाओं को स्थिर करके काम करता है। जबकि मेथनॉल सेलुलर प्रोटीन और एंटीजन को संरक्षित करने में प्रभावी है, यह कोशिका सिकुड़न का कारण बन सकता है, जो कोशिका आकार और आकृति विज्ञान जैसी कुछ विशेषताओं की व्याख्या को प्रभावित कर सकता है।

सिफारिश:

● एकाग्रता: आमतौर पर, 90-100% मेथनॉल का उपयोग किया जाता है।

● निर्धारण समय: आमतौर पर 10-15 मिनट पर्याप्त होता है।

मेथनॉल निर्धारण का उपयोग अक्सर इंट्रासेल्युलर प्रोटीन का अध्ययन करते समय किया जाता है, खासकर जब साइटोप्लाज्म या न्यूक्लियस के अंदर मार्करों की जांच की जाती है। हालाँकि, शोधकर्ताओं को मेथनॉल निर्धारण का उपयोग करते समय कोशिका सिकुड़न की संभावना पर विचार करना चाहिए।

अन्य फिक्सेटिव्स (उदाहरण के लिए, फॉर्मेलिन)

फॉर्मेलिन, पानी में फॉर्मेल्डिहाइड का एक घोल, फ्लो साइटोमेट्री में उपयोग किया जाने वाला एक अन्य फिक्सेटिव है, हालांकि यह पीएफए ​​की तुलना में कम आम है। फॉर्मेलिन का व्यापक रूप से ऊतक विज्ञान और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री में उपयोग किया जाता है, जहां यह सूक्ष्म विश्लेषण के लिए ऊतक के नमूनों को प्रभावी ढंग से संरक्षित करता है। यद्यपि फॉर्मेलिन कोशिका संरचनाओं को संरक्षित कर सकता है, लेकिन आम तौर पर प्रवाह साइटोमेट्री के लिए इसकी अनुशंसा नहीं की जाती है जब तक कि यह निश्चित ऊतक नमूनों के साथ काम नहीं करता है, क्योंकि यह कोशिका छंटाई और कुछ प्रतिदीप्ति अनुप्रयोगों में हस्तक्षेप कर सकता है। फॉर्मेलिन निर्धारण ऊतक नमूनों के लिए सबसे उपयुक्त है, व्यक्तिगत कोशिकाओं के लिए नहीं।

 

बंधक	एकाग्रता	निर्धारण समय	अनुशंसित उपयोग
पैराफॉर्मल्डिहाइड (पीएफए)	2-4%	15-30 मिनट	कोशिका सतह मार्करों को संरक्षित करने के लिए आदर्श; इम्यूनोफेनोटाइपिंग के लिए सामान्य
इथेनॉल	70-100%	10-15 मिनट	डीएनए सामग्री विश्लेषण और कोशिका चक्र अध्ययन के लिए सर्वोत्तम
मेथनॉल	90-100%	10-15 मिनट	इंट्रासेल्युलर प्रोटीन विश्लेषण के लिए उपयुक्त; कोशिका सिकुड़न का कारण बन सकता है
फॉर्मेलिन	10% (फॉर्मेल्डिहाइड)	भिन्न होता है (ऊतक पर निर्भर करता है)	आम तौर पर निश्चित ऊतक नमूनों के लिए उपयोग किया जाता है, व्यक्तिगत कोशिकाओं के लिए नहीं

 

फ्लो साइटोमेट्री के लिए कोशिकाओं को ठीक करने के लिए चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका

सेल नमूना तैयार करना

निर्धारण से पहले, कोशिकाओं को ऊतक या रक्त के नमूने से अलग करना आवश्यक है। सस्पेंशन में कोशिकाओं को केंद्रित करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन सबसे आम तरीका है। किसी भी कल्चर मीडिया या अवशिष्ट संदूषक को हटाने के लिए कोशिकाओं को अच्छी तरह से धोना भी महत्वपूर्ण है, जो निर्धारण प्रक्रिया में हस्तक्षेप कर सकता है।

 

1. सेल अलगाव: रुचि की कोशिकाओं को अलग करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन या सेल सॉर्टिंग जैसे मानक अलगाव तरीकों का उपयोग करें।

2. धुलाई: अवशिष्ट मीडिया और दूषित पदार्थों को हटाने के लिए कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफ़र्ड सेलाइन (पीबीएस) से धोएं जो निर्धारण प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं।

निर्धारण प्रक्रिया

एक बार कोशिकाएं तैयार हो जाने के बाद, अगला कदम सेल सस्पेंशन में फिक्सेटिव जोड़ना है। फ्लो साइटोमेट्री के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला फिक्सेटिव 2-4% पीएफए ​​समाधान है।

1. सेल सस्पेंशन में फिक्सेटिव मिलाएं, यह सुनिश्चित करते हुए कि यह अच्छी तरह से मिश्रित है।

2. कोशिकाओं को 2-8°C पर 15-30 मिनट के लिए फिक्सेटिव से सेते रहें।

3. ऊष्मायन के बाद, अतिरिक्त फिक्सेटिव को हटाने के लिए कोशिकाओं को पीबीएस से दो बार धोएं।

निर्धारण के बाद के चरण

निर्धारण के बाद, कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक संभाला जाना चाहिए। यदि आगे के विश्लेषण की आवश्यकता है, तो विश्लेषण से पहले कोशिकाओं को दाग दिया जाना चाहिए। यदि आप भविष्य के विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को संग्रहीत करने की योजना बना रहे हैं, तो उन्हें उचित बफर में पुनः निलंबित करें और उन्हें 2-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें। लंबी अवधि के लिए फिक्सेटिव में कोशिकाओं को छोड़ने से बचें, क्योंकि ओवर-फिक्सेशन से ऑटोफ्लोरेसेंस में वृद्धि हो सकती है और सिग्नल की गुणवत्ता कम हो सकती है।

 

फ्लो साइटोमेट्री में इष्टतम निर्धारण के लिए युक्तियाँ

अति-निर्धारण से बचना

ओवर-फिक्सेशन तब होता है जब कोशिकाएं बहुत लंबे समय तक फिक्सेटिव के संपर्क में रहती हैं, जिसके परिणामस्वरूप सेलुलर प्रोटीन की अत्यधिक क्रॉस-लिंकिंग हो सकती है और डेटा की गुणवत्ता से समझौता हो सकता है। इससे ऑटोफ्लोरेसेंस, एंटीबॉडी बंधन में कमी और गलत प्रवाह साइटोमेट्री माप हो सकता है। हमेशा अपने विशिष्ट सेल प्रकार के लिए अनुशंसित निर्धारण समय की जांच करें और अति-निर्धारण से बचने के लिए प्रयोग करें।

निर्धारण समय बनाम नमूना प्रकार

इष्टतम निर्धारण समय सेल प्रकार और प्रयोग की प्रकृति के आधार पर भिन्न हो सकता है। उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ऊतक के नमूनों की तुलना में कम निर्धारण समय की आवश्यकता हो सकती है। नमूना प्रकार की विशिष्ट आवश्यकताओं के आधार पर निर्धारण समय को समायोजित करें। सतह प्रोटीन विश्लेषण के लिए, आमतौर पर कम निर्धारण समय (10-15 मिनट) पर्याप्त होता है। इंट्रासेल्युलर स्टेनिंग या डीएनए विश्लेषण के लिए, लंबे निर्धारण समय की आवश्यकता हो सकती है।

निर्धारण के बाद धुंधलापन

कोशिकाओं को ठीक करने के बाद, एंटीबॉडी या फ्लोरोसेंट रंगों से धुंधला करना फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण में एक महत्वपूर्ण कदम है। कुछ फ्लोरोसेंट रंग, विशेष रूप से टेंडेम रंग, निर्धारण के प्रति संवेदनशील हो सकते हैं और यदि कोशिकाएं अधिक स्थिर हो जाती हैं तो ख़राब हो सकती हैं। इष्टतम धुंधला परिणामों के लिए, जब भी संभव हो निर्धारण से पहले कोशिकाओं को दागने की सिफारिश की जाती है। यह डाई के क्षरण को रोकने और मजबूत प्रतिदीप्ति संकेतों को सुनिश्चित करने में मदद कर सकता है।

 

फ्लो साइटोमेट्री के लिए स्थिर कोशिकाओं का भंडारण

अल्पकालिक भंडारण

अल्पकालिक भंडारण के लिए, स्थिर कोशिकाओं को रेफ्रिजरेटर में 2-8°C पर संग्रहित किया जा सकता है। यह आदर्श है जब आप निर्धारण के बाद एक या दो दिन के भीतर कोशिकाओं का विश्लेषण करने की योजना बनाते हैं। फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए स्थिर कोशिकाओं को हमेशा अंधेरे में रखें, जो फ्लोरोसेंट संकेतों को प्रभावित कर सकता है।

दीर्घावधि संग्रहण

दीर्घकालिक भंडारण के लिए, कोशिकाओं को क्रायोप्रिजर्वेशन मीडिया में जमाया जा सकता है। एक विशिष्ट क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम में 10% डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) और 90% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) होते हैं। हालाँकि, mFreSR™ या CryoStor™ CS10 जैसे सीरम-मुक्त क्रायोप्रिजर्वेशन समाधान भी उपलब्ध हैं और FBS से जुड़ी समस्याओं से बचने के लिए इसका उपयोग किया जा सकता है। बर्फ के क्रिस्टल के निर्माण को रोकने के लिए, कोशिकाओं को फ्रीज करने के लिए नियंत्रित दर वाले फ्रीजर का उपयोग करें। यह सेल व्यवहार्यता बनाए रखने में मदद करता है और उचित भंडारण सुनिश्चित करता है।

 

फ्लो साइटोमेट्री के लिए सेल फिक्सेशन में बचने के लिए सामान्य नुकसान

अनुचित निर्धारण के प्रभाव

अनुचित निर्धारण से कई समस्याएं हो सकती हैं, जिनमें ऑटोफ्लोरेसेंस, कम एंटीबॉडी बाइंडिंग और खराब सेल व्यवहार्यता शामिल है। ये मुद्दे फ्लो साइटोमेट्री परिणामों की सटीकता और विश्वसनीयता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकते हैं। हमेशा अपने विशिष्ट नमूना प्रकार के लिए निर्धारण प्रोटोकॉल को सत्यापित करें, और सुनिश्चित करें कि विश्लेषण की जा रही सेल प्रकार और मार्करों के लिए निर्धारण स्थितियां उपयुक्त हैं।

अपने आवेदन के लिए सही फिक्सेटिव का चयन करना

विश्वसनीय और सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए आपके फ्लो साइटोमेट्री प्रयोग के लिए उपयुक्त फिक्सेटिव का चयन करना महत्वपूर्ण है। अलग-अलग अनुप्रयोगों के लिए अलग-अलग फिक्सेटिव बेहतर अनुकूल होते हैं। उदाहरण के लिए, पीएफए ​​का उपयोग आमतौर पर सतह प्रोटीन विश्लेषण के लिए किया जाता है, जबकि इथेनॉल डीएनए-आधारित अध्ययन के लिए आदर्श है। प्रयोग शुरू करने से पहले, अपने विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए सर्वोत्तम फिक्सेटिव पर शोध करें और तदनुसार फिक्सेशन प्रोटोकॉल को समायोजित करें।

 

निष्कर्ष

सफल प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण प्राप्त करने के लिए उचित सेल निर्धारण आवश्यक है। यह सेलुलर संरचनाओं को संरक्षित करने में मदद करता है और प्रोटीन और डीएनए की अखंडता सुनिश्चित करता है। उचित निर्धारण प्रोटोकॉल का पालन करके और अति-निर्धारण से बचकर, शोधकर्ता डेटा सटीकता और विश्वसनीयता बढ़ा सकते हैं। अपने प्रयोग के लिए उपयुक्त फिक्सेटिव का चयन करने से आपके परिणामों की समग्र गुणवत्ता में सुधार होता है। इन सर्वोत्तम प्रथाओं को लागू करने से यह सुनिश्चित होता है कि आपका प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सेलुलर कार्यों में सुसंगत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

 

उचित कोशिका निर्धारण प्रवाह साइटोमेट्री और उत्पादों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है HKeybio विश्वसनीय समाधान प्रदान करता है। उनकी पेशकशें उच्च-गुणवत्ता वाले परिणाम सुनिश्चित करती हैं और सटीक सेल विश्लेषण के लिए दुनिया भर के शोधकर्ताओं द्वारा उन पर भरोसा किया जाता है।

 

अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न

प्रश्न: फ्लो साइटोमेट्री में कोशिका निर्धारण का क्या महत्व है?

ए: फ्लो साइटोमेट्री में सेल निर्धारण महत्वपूर्ण है क्योंकि यह सेलुलर संरचनाओं को संरक्षित करता है और सटीक विश्लेषण के लिए प्रोटीन और डीएनए की अखंडता सुनिश्चित करता है।

प्रश्न: फ्लो साइटोमेट्री के लिए कोशिकाओं को कितने समय तक स्थिर रखा जाना चाहिए?

उत्तर: सेलुलर अखंडता बनाए रखने के लिए कोशिकाओं को आम तौर पर 2-4% पैराफॉर्मल्डिहाइड (पीएफए) समाधान के साथ 15-30 मिनट के लिए ठीक किया जाना चाहिए।

प्रश्न: क्या मैं फ्लो साइटोमेट्री में सेल निर्धारण के लिए इथेनॉल का उपयोग कर सकता हूं?

उत्तर: हाँ, इथेनॉल निर्धारण का उपयोग आमतौर पर फ्लो साइटोमेट्री में डीएनए सामग्री विश्लेषण के लिए किया जाता है, विशेष रूप से कोशिका चक्र अध्ययन के लिए।

प्रश्न: यदि फ्लो साइटोमेट्री में कोशिकाएं अति-स्थिर हो जाएं तो क्या होगा?

ए: ओवर-फिक्सेशन अत्यधिक क्रॉस-लिंकिंग का कारण बन सकता है, जिससे ऑटोफ्लोरेसेंस और खराब एंटीबॉडी बाइंडिंग हो सकती है, जो फ्लो साइटोमेट्री परिणामों को प्रभावित कर सकती है।