Giới thiệu
Bạn đã bao giờ tự hỏi làm thế nào phương pháp tế bào học dòng chảy đạt được sự phân tích tế bào chính xác và đáng tin cậy như vậy? Chìa khóa cho kết quả chính xác nằm ở việc cố định tế bào thích hợp. Phương pháp tế bào học dòng chảy cho phép các nhà nghiên cứu nghiên cứu nhiều đặc điểm khác nhau của tế bào, từ kích thước đến cường độ huỳnh quang. Tuy nhiên, nếu không có sự cố định thích hợp, dữ liệu có thể không phản ánh đúng các đặc tính của tế bào. Trong bài viết này, chúng ta sẽ tìm hiểu tầm quan trọng của việc cố định tế bào trong phương pháp tế bào học dòng chảy, thảo luận về các phương pháp cố định khác nhau và chia sẻ các mẹo để có kết quả tối ưu.
Cố định tế bào trong phương pháp tế bào học dòng chảy là gì?
Định nghĩa cố định tế bào
Cố định tế bào là một quá trình ổn định và bảo tồn tế bào bằng cách ngăn chặn những thay đổi về cấu trúc, chức năng và thành phần phân tử của chúng. Quá trình này đạt được bằng cách liên kết ngang các protein, lipid và các thành phần tế bào khác về mặt hóa học, 'đóng băng' các tế bào ở trạng thái hiện tại một cách hiệu quả. Điều này đặc biệt quan trọng trong phương pháp tế bào học dòng chảy vì nó ngăn chặn sự xuống cấp của các dấu hiệu tế bào hoặc sự thay đổi cấu trúc tế bào trong quá trình phân tích. Bằng cách cố định các tế bào, các nhà nghiên cứu có thể đảm bảo rằng các đặc tính của tế bào vẫn nhất quán, cho phép thực hiện các phép đo chính xác và dữ liệu đáng tin cậy trong quá trình phân tích tế bào học dòng chảy.
Tại sao việc cố định lại quan trọng
Việc cố định thích hợp là cần thiết vì nó duy trì tính toàn vẹn của protein và axit nucleic của tế bào, những yếu tố rất quan trọng để phân tích tế bào học dòng chảy chính xác. Nếu tế bào không được cố định, cấu trúc và dấu hiệu phân tử của chúng có thể bị suy giảm hoặc thay đổi theo thời gian, dẫn đến kết quả không đáng tin cậy và không chính xác. Sự cố định cũng đóng một vai trò quan trọng trong việc ổn định tế bào để phân tích đa thông số, đây là một trong những điểm mạnh chính của phương pháp tế bào học dòng chảy. Nó cho phép các nhà nghiên cứu đánh giá đồng thời nhiều đặc điểm của tế bào, chẳng hạn như các dấu hiệu bề mặt, protein nội bào và hàm lượng DNA, trong một thí nghiệm duy nhất. Nếu không có sự cố định thích hợp, dữ liệu thu được có thể không nhất quán hoặc không đầy đủ, dẫn đến giải thích sai về kết quả thử nghiệm.
Các loại phương pháp cố định cho phép đo tế bào dòng chảy
Cố định Paraformaldehyde (PFA)
Paraformaldehyde (PFA) là một trong những chất cố định được sử dụng rộng rãi nhất trong phương pháp tế bào học dòng chảy, chủ yếu là do tính hiệu quả của nó trong việc bảo tồn hình thái tế bào và tính kháng nguyên. Nó hoạt động bằng cách liên kết ngang các protein trong tế bào, đảm bảo rằng cả cấu trúc tế bào và protein bề mặt vẫn còn nguyên vẹn. Điều này làm cho PFA trở thành sự lựa chọn tuyệt vời để bảo quản các dấu hiệu bề mặt tế bào, đặc biệt là khi phân tích biểu hiện protein bề mặt trong các thí nghiệm mô hình miễn dịch.
Sự giới thiệu:
● Nồng độ: 2-4% PFA thường được sử dụng để cố định tối ưu.
● Thời gian cố định: Tế bào nên được ủ trong PFA trong 15-30 phút ở 2-8°C.
● Bảo quản: Sau khi cố định, tế bào phải được bảo quản ở nhiệt độ 2-8°C để bảo quản trong thời gian ngắn. Điều quan trọng là không lưu trữ các ô cố định trong thời gian dài vì điều này có thể dẫn đến mất tính toàn vẹn của điểm đánh dấu.
Điều quan trọng là tránh cố định quá mức, vì việc tiếp xúc kéo dài với PFA có thể dẫn đến hiện tượng tự phát huỳnh quang của tế bào và cản trở quá trình nhuộm và phân tích tiếp theo. Luôn sử dụng lượng thời gian tối thiểu cần thiết để cố định.
Cố định Ethanol
Việc cố định ethanol thường được sử dụng khi trọng tâm của phân tích là hàm lượng DNA, chẳng hạn như trong nghiên cứu chu trình tế bào. Ethanol là chất khử nước hoạt động bằng cách thâm nhập vào màng tế bào và bảo tồn DNA trong tế bào. Điều này làm cho việc cố định ethanol đặc biệt hữu ích cho các xét nghiệm dựa trên DNA và phân tích tế bào học dòng chảy trong đó các giai đoạn chu kỳ tế bào hoặc hàm lượng DNA đang được kiểm tra.
Sự giới thiệu:
● Nồng độ: Thông thường sử dụng 70-100% ethanol.
● Thời gian cố định: Quá trình cố định Ethanol thường cần 10-15 phút để có kết quả tối ưu.
Việc cố định ethanol là giải pháp lý tưởng để bảo toàn các giai đoạn của chu kỳ tế bào và nó có thể được sử dụng kết hợp với các thuốc nhuộm liên kết DNA như propidium iodide (PI) để phân tích chu kỳ tế bào.
Cố định metanol
Metanol là một chất cố định thường được sử dụng khác, đặc biệt là để phân tích nội bào. Nó hoạt động bằng cách thâm nhập vào màng tế bào và ổn định cấu trúc bên trong của tế bào. Mặc dù metanol có hiệu quả trong việc bảo tồn protein và kháng nguyên của tế bào, nhưng nó có thể gây co rút tế bào, điều này có thể ảnh hưởng đến việc giải thích một số đặc điểm nhất định, chẳng hạn như kích thước và hình thái tế bào.
Sự giới thiệu:
● Nồng độ: Thông thường sử dụng 90-100% metanol.
● Thời gian cố định: thường là 10-15 phút là đủ.
Việc cố định metanol thường được sử dụng khi nghiên cứu protein nội bào, đặc biệt là khi kiểm tra các dấu hiệu bên trong tế bào chất hoặc nhân. Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu nên xem xét khả năng co rút tế bào khi sử dụng phương pháp cố định metanol.
Các chất cố định khác (ví dụ Formalin)
Formalin, dung dịch formaldehyde trong nước, là một chất cố định khác được sử dụng trong phương pháp tế bào học dòng chảy, mặc dù nó ít phổ biến hơn PFA. Formalin được sử dụng rộng rãi trong mô học và hóa mô miễn dịch, trong đó nó bảo quản hiệu quả các mẫu mô để phân tích dưới kính hiển vi. Mặc dù formalin có thể bảo tồn cấu trúc tế bào nhưng nhìn chung nó không được khuyến khích cho phép đo tế bào dòng chảy trừ khi làm việc với các mẫu mô cố định, vì nó có thể cản trở việc phân loại tế bào và một số ứng dụng huỳnh quang. Việc cố định formalin phù hợp nhất cho các mẫu mô chứ không phải cho từng tế bào.
cố định |
Sự tập trung |
Thời gian cố định |
Cách sử dụng được đề xuất |
Paraformaldehyde (PFA) |
2-4% |
15-30 phút |
Lý tưởng để bảo quản các dấu hiệu bề mặt tế bào; phổ biến cho kiểu hình miễn dịch |
Ethanol |
70-100% |
10-15 phút |
Tốt nhất cho việc phân tích hàm lượng DNA và nghiên cứu chu kỳ tế bào |
Metanol |
90-100% |
10-15 phút |
Thích hợp cho phân tích protein nội bào; có thể gây co rút tế bào |
Formalin |
10% (formaldehyde) |
Khác nhau (phụ thuộc vào mô) |
Thường được sử dụng cho các mẫu mô cố định, không dùng cho từng tế bào |
Hướng dẫn từng bước để cố định tế bào cho phép đo tế bào dòng chảy
Chuẩn bị mẫu tế bào
Trước khi cố định, điều cần thiết là phải tách tế bào ra khỏi mô hoặc mẫu máu. Ly tâm là phương pháp phổ biến nhất được sử dụng để cô đặc tế bào ở dạng huyền phù. Điều quan trọng nữa là phải rửa kỹ tế bào để loại bỏ bất kỳ môi trường nuôi cấy hoặc chất gây ô nhiễm còn sót lại nào có thể cản trở quá trình cố định.
1. Tách tế bào: Sử dụng các phương pháp cách ly tiêu chuẩn như ly tâm hoặc phân loại tế bào để tách các tế bào quan tâm.
2. Rửa: Rửa tế bào bằng dung dịch muối đệm phốt phát (PBS) để loại bỏ môi trường còn sót lại và các chất gây ô nhiễm có thể ảnh hưởng đến quá trình cố định.
Thủ tục cố định
Sau khi chuẩn bị xong tế bào, bước tiếp theo là thêm chất cố định vào huyền phù tế bào. Chất cố định được sử dụng phổ biến nhất cho phương pháp tế bào học dòng chảy là dung dịch PFA 2-4%.
1. Thêm chất cố định vào huyền phù tế bào, đảm bảo nó được trộn đều.
2. Ủ tế bào với chất cố định trong 15-30 phút ở 2-8°C.
3. Sau khi ủ, rửa tế bào hai lần bằng PBS để loại bỏ chất cố định dư thừa.
Các bước sau khi cố định
Sau khi cố định, các tế bào phải được xử lý cẩn thận. Nếu cần phân tích thêm, tế bào phải được nhuộm màu trước khi phân tích. Nếu bạn dự định bảo quản tế bào để phân tích sau này, hãy hòa lại chúng trong dung dịch đệm thích hợp và bảo quản chúng ở nhiệt độ 2-8°C. Tránh để tế bào cố định trong thời gian dài, vì việc cố định quá mức có thể dẫn đến tăng khả năng tự phát huỳnh quang và giảm chất lượng tín hiệu.
Lời khuyên để cố định tối ưu trong phép đo tế bào dòng chảy
Tránh cố định quá mức
Quá trình cố định quá mức xảy ra khi tế bào tiếp xúc với chất cố định quá lâu, điều này có thể dẫn đến liên kết chéo quá mức giữa các protein của tế bào và làm ảnh hưởng đến chất lượng của dữ liệu. Điều này có thể dẫn đến hiện tượng tự phát huỳnh quang, giảm liên kết kháng thể và đo tế bào dòng chảy không chính xác. Luôn kiểm tra thời gian cố định được khuyến nghị cho loại tế bào cụ thể của bạn và thử nghiệm để tránh cố định quá mức.
Thời gian cố định so với loại mẫu
Thời gian cố định tối ưu có thể khác nhau tùy thuộc vào loại tế bào và tính chất của thí nghiệm. Ví dụ, tế bào miễn dịch có thể yêu cầu thời gian cố định ngắn hơn so với mẫu mô. Điều chỉnh thời gian cố định dựa trên nhu cầu cụ thể của loại mẫu. Để phân tích protein bề mặt, thời gian cố định ngắn hơn (10-15 phút) thường là đủ. Để nhuộm nội bào hoặc phân tích DNA, có thể cần thời gian cố định lâu hơn.
Nhuộm sau khi cố định
Sau khi cố định tế bào, nhuộm bằng kháng thể hoặc thuốc nhuộm huỳnh quang là một bước quan trọng trong phân tích tế bào học dòng chảy. Một số thuốc nhuộm huỳnh quang, đặc biệt là thuốc nhuộm song song, có thể nhạy cảm với quá trình cố định và có thể xuống cấp nếu tế bào bị cố định quá mức. Để có kết quả nhuộm tối ưu, nên nhuộm tế bào trước khi cố định bất cứ khi nào có thể. Điều này có thể giúp ngăn ngừa sự xuống cấp của thuốc nhuộm và đảm bảo tín hiệu huỳnh quang mạnh hơn.
Lưu trữ các tế bào cố định để đo tế bào dòng chảy
Lưu trữ ngắn hạn
Để bảo quản ngắn hạn, các tế bào cố định có thể được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2-8°C. Điều này lý tưởng khi bạn định phân tích tế bào trong vòng một hoặc hai ngày sau khi cố định. Luôn bảo quản các tế bào cố định trong bóng tối để tránh hiện tượng tẩy quang, có thể ảnh hưởng đến tín hiệu huỳnh quang.
Lưu trữ dài hạn
Để lưu trữ lâu dài, tế bào có thể được đông lạnh trong môi trường bảo quản lạnh. Môi trường bảo quản lạnh điển hình bao gồm 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) và 90% huyết thanh bào thai bò (FBS). Tuy nhiên, các giải pháp bảo quản lạnh không cần huyết thanh như mFreSR™ hoặc CryoStor™ CS10 cũng có sẵn và có thể được sử dụng để tránh các vấn đề liên quan đến FBS. Để ngăn chặn sự hình thành tinh thể băng, hãy sử dụng máy cấp đông có tốc độ kiểm soát để đông lạnh tế bào. Điều này giúp duy trì khả năng tồn tại của tế bào và đảm bảo lưu trữ thích hợp.
Những cạm bẫy phổ biến cần tránh trong quá trình cố định tế bào cho phép đo tế bào dòng chảy
Ảnh hưởng của việc cố định không đúng cách
Việc cố định không đúng cách có thể dẫn đến một số vấn đề, bao gồm tự phát huỳnh quang, giảm liên kết kháng thể và khả năng sống sót của tế bào kém. Những vấn đề này có thể ảnh hưởng đáng kể đến độ chính xác và độ tin cậy của kết quả tế bào học dòng chảy. Luôn xác minh các quy trình cố định cho loại mẫu cụ thể của bạn và đảm bảo rằng các điều kiện cố định phù hợp với loại tế bào và điểm đánh dấu được phân tích.
Chọn chất cố định phù hợp cho ứng dụng của bạn
Việc chọn chất cố định thích hợp cho thí nghiệm đo tế bào theo dòng chảy là rất quan trọng để thu được kết quả chính xác và đáng tin cậy. Các chất cố định khác nhau phù hợp hơn cho các ứng dụng khác nhau. Ví dụ, PFA thường được sử dụng để phân tích protein bề mặt, trong khi ethanol là lý tưởng cho các nghiên cứu dựa trên DNA. Trước khi bắt đầu thử nghiệm, hãy nghiên cứu chất cố định tốt nhất cho ứng dụng cụ thể của bạn và điều chỉnh quy trình cố định cho phù hợp.
Phần kết luận
Việc cố định tế bào thích hợp là điều cần thiết để đạt được thành công trong phân tích tế bào học dòng chảy. Nó giúp bảo tồn cấu trúc tế bào và đảm bảo tính toàn vẹn của protein và DNA. Bằng cách tuân theo các giao thức cố định thích hợp và tránh cố định quá mức, các nhà nghiên cứu có thể nâng cao độ chính xác và độ tin cậy của dữ liệu. Việc chọn chất cố định thích hợp cho thử nghiệm của bạn sẽ cải thiện chất lượng tổng thể của kết quả. Việc triển khai các phương pháp thực hành tốt nhất này đảm bảo rằng phân tích tế bào học dòng chảy của bạn cung cấp những hiểu biết nhất quán, có thể tái tạo về các chức năng của tế bào.
Sự cố định tế bào thích hợp đóng một vai trò quan trọng trong phương pháp tế bào học dòng chảy và các sản phẩm từ HKeybio cung cấp các giải pháp đáng tin cậy. Các sản phẩm của họ đảm bảo kết quả chất lượng cao và được các nhà nghiên cứu trên toàn thế giới tin cậy để phân tích tế bào chính xác.
Câu hỏi thường gặp
Hỏi: Tầm quan trọng của việc cố định tế bào trong phương pháp tế bào học dòng chảy là gì?
Đáp: Cố định tế bào là rất quan trọng trong phương pháp tế bào học dòng chảy vì nó bảo tồn cấu trúc tế bào và đảm bảo tính toàn vẹn của protein và DNA để phân tích chính xác.
Hỏi: Tế bào cần được cố định trong bao lâu để đo tế bào theo dòng chảy?
Trả lời: Thông thường, tế bào phải được cố định trong 15-30 phút bằng dung dịch paraformaldehyde 2-4% (PFA) để duy trì tính toàn vẹn của tế bào.
Hỏi: Tôi có thể sử dụng ethanol để cố định tế bào trong phương pháp tế bào học dòng chảy không?
Trả lời: Có, quá trình cố định ethanol thường được sử dụng để phân tích hàm lượng DNA trong phương pháp tế bào học dòng chảy, đặc biệt là cho các nghiên cứu chu trình tế bào.
Hỏi: Điều gì xảy ra nếu tế bào bị cố định quá mức trong phương pháp tế bào học dòng chảy?
Trả lời: Việc cố định quá mức có thể gây ra liên kết chéo quá mức, dẫn đến hiện tượng tự phát huỳnh quang và liên kết kháng thể kém, điều này có thể ảnh hưởng đến kết quả tế bào học dòng chảy.
