Оршил
Яаж гэж бодож байсан уу Урсгалын цитометр ийм нарийн бөгөөд найдвартай эсийн шинжилгээнд хүрдэг үү? Нарийвчлалтай үр дүнд хүрэх түлхүүр нь эсийн зөв бэхэлгээнд оршдог. Урсгалын цитометр нь судлаачдад хэмжээнээс эхлээд флюресценцийн эрч хүч хүртэл янз бүрийн эсийн шинж чанарыг судлах боломжийг олгодог. Гэсэн хэдий ч зөв тогтоогоогүй тохиолдолд өгөгдөл нь эсийн жинхэнэ шинж чанарыг тусгахгүй байж магадгүй юм. Энэ нийтлэлд бид урсгалын цитометр дэх эсийн бэхэлгээний ач холбогдлыг судалж, янз бүрийн бэхэлгээний аргуудын талаар ярилцаж, оновчтой үр дүнд хүрэх зөвлөмжийг хуваалцах болно.
Урсгалын цитометр дэх эсийн бэхэлгээ гэж юу вэ?
Эсийн бэхэлгээний тодорхойлолт
Эсийн бэхжилт нь эсийн бүтэц, үйл ажиллагаа, молекулын найрлагад өөрчлөлт орохоос сэргийлж, тогтворжуулах, хадгалах үйл явц юм. Энэ процесс нь уураг, липид болон бусад эсийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг химийн аргаар холбосноор эсийг одоогийн төлөв байдалд нь үр дүнтэй 'хөлдөх' замаар хийгддэг. Шинжилгээний явцад эсийн тэмдэглэгээг задлах эсвэл эсийн бүтцийг өөрчлөхөөс сэргийлдэг тул энэ нь урсгалын цитометрийн хувьд онцгой ач холбогдолтой юм. Судлаачид эсийг зассанаар эсийн шинж чанар тогтвортой хэвээр байгаа бөгөөд энэ нь урсгалын цитометрийн шинжилгээний явцад нарийн хэмжилт хийх, найдвартай мэдээлэл авах боломжийг олгодог.
Яагаад засах нь чухал вэ?
Урсгалын цитометрийн шинжилгээнд нэн чухал үүрэгтэй эсийн уураг болон нуклейн хүчлүүдийн бүрэн бүтэн байдлыг хадгалж байдаг тул зөв бэхлэх нь чухал юм. Хэрэв эсүүд тогтворгүй бол тэдгээрийн бүтэц, молекулын маркерууд цаг хугацааны явцад муудаж эсвэл өөрчлөгдөж, найдваргүй, буруу үр дүнд хүргэдэг. Фиксжуулалт нь олон параметрийн шинжилгээнд зориулж эсийг тогтворжуулахад чухал үүрэг гүйцэтгэдэг бөгөөд энэ нь урсгалын цитометрийн гол давуу талуудын нэг юм. Энэ нь судлаачдад нэг туршилтаар гадаргуугийн маркер, эсийн доторх уураг, ДНХ-ийн агууламж зэрэг олон эсийн шинж чанарыг нэгэн зэрэг үнэлэх боломжийг олгодог. Зохих ёсоор тогтоогоогүй тохиолдолд олж авсан өгөгдөл нь зөрүүтэй эсвэл бүрэн бус байж болох бөгөөд энэ нь туршилтын үр дүнг буруу тайлбарлахад хүргэдэг.
Урсгалын цитометрийн бэхэлгээний аргуудын төрлүүд
Параформальдегид (PFA) бэхэлгээ
Параформальдегид (PFA) нь урсгалын цитометрийн хамгийн өргөн хэрэглэгддэг бэхэлгээний нэг бөгөөд үндсэндээ эсийн морфологи, эсрэгтөрөгчийг хадгалах үр дүнтэй байдаг. Энэ нь эсийн доторх уурагуудыг хооронд нь холбож, эсийн бүтэц болон гадаргуугийн уураг хоёуланг нь бүрэн бүтэн байлгах замаар ажилладаг. Энэ нь PFA нь эсийн гадаргуугийн тэмдэглэгээг хадгалах, ялангуяа иммунофенотипийн туршилтанд гадаргуугийн уургийн илэрхийлэлд дүн шинжилгээ хийхэд маш сайн сонголт болгодог.
Зөвлөмж:
● Концентраци: 2-4% PFA-ийг оновчтой бэхэлгээнд ихэвчлэн ашигладаг.
● Бэхжүүлэх хугацаа: Эсийг PFA-д 2-8°С-т 15-30 минутын турш өсгөвөрлөнө.
● Хадгалалт: Эсийг бэхэлсэний дараа богино хугацаанд хадгалахын тулд 2-8°С хэмд хадгална. Тогтмол эсийг удаан хугацаагаар хадгалахгүй байх нь чухал бөгөөд энэ нь маркерын бүрэн бүтэн байдлыг алдагдуулж болзошгүй юм.
PFA-д удаан хугацаагаар өртөх нь эсийн автофлуоресценцийг үүсгэж, дараагийн будалт, шинжилгээнд саад учруулж болзошгүй тул хэт бэхэлгээнээс зайлсхийх нь чухал юм. Бэхэлгээ хийхэд шаардагдах хамгийн бага хугацааг үргэлж ашигла.
Этанол бэхлэх
ДНХ-ийн агуулгад, тухайлбал эсийн мөчлөгийн судалгаанд шинжилгээ хийхэд голлон этанол тогтоодог. Этанол нь эсийн мембран руу нэвтэрч, эсийн доторх ДНХ-ийг хадгалах замаар ажилладаг усгүйжүүлэгч бодис юм. Энэ нь этанолын бэхжилтийг ДНХ-д суурилсан шинжилгээ болон эсийн мөчлөгийн үе шатууд эсвэл ДНХ-ийн агуулгыг судалж буй урсгалын цитометрийн шинжилгээнд онцгой ач холбогдолтой болгодог.
Зөвлөмж:
● Баяжуулалт: Ихэвчлэн 70-100% этилийн спирт хэрэглэдэг.
● Тохируулах хугацаа: Этанол бэхлэх нь оновчтой үр дүнд хүрэхийн тулд ихэвчлэн 10-15 минут шаарддаг.
Этанолыг бэхлэх нь эсийн мөчлөгийн үе шатуудыг хадгалахад тохиромжтой бөгөөд эсийн мөчлөгийн шинжилгээнд пропидиум иодид (PI) зэрэг ДНХ холбогч будагч бодисуудтай хослуулан хэрэглэж болно.
Метанол бэхэлгээ
Метанол бол эсийн доторх шинжилгээнд өргөн хэрэглэгддэг өөр нэг бэхэлгээ юм. Энэ нь эсийн мембраныг нэвтлэн эсийн дотоод бүтцийг тогтворжуулах замаар ажилладаг. Метанол нь эсийн уураг, эсрэгтөрөгчийг хадгалахад үр дүнтэй боловч эсийн агшилтыг үүсгэж, эсийн хэмжээ, морфологи гэх мэт тодорхой шинж чанаруудын тайлбарт нөлөөлж болзошгүй.
Зөвлөмж:
● Баяжуулалт: Ихэвчлэн 90-100% метанол хэрэглэдэг.
● Тохируулах хугацаа: Ихэвчлэн 10-15 минут хангалттай.
Метанол бэхэлгээг ихэвчлэн эсийн доторх уураг судлах, ялангуяа цитоплазм эсвэл цөм доторх маркеруудыг судлахад ашигладаг. Гэсэн хэдий ч судлаачид метанол бэхэлгээг ашиглахдаа эсийн агшилтын боломжийг анхаарч үзэх хэрэгтэй.
Бусад бэхэлгээний бодисууд (жишээ нь, формалин)
Формалин, усан дахь формальдегидийн уусмал нь урсгалын цитометрт хэрэглэгддэг өөр нэг бэхлэгч боловч энэ нь PFA-аас бага түгээмэл байдаг. Формалин нь гистологи, иммуногистохимид өргөн хэрэглэгддэг бөгөөд эд эсийн дээжийг бичил харуурын шинжилгээнд үр дүнтэй хадгалдаг. Формалин нь эсийн бүтцийг хадгалж чаддаг ч эсийн ялгах болон зарим флюресценцийн хэрэглээнд саад учруулж болзошгүй тул тогтмол эд эсийн дээжтэй ажиллахаас бусад тохиолдолд урсгалын цитометрийг ерөнхийд нь хэрэглэхийг зөвлөдөггүй. Формалиныг бэхлэх нь бие даасан эсүүдэд биш харин эд эсийн дээжинд хамгийн тохиромжтой байдаг.
Тохируулах |
Төвлөрөл |
Тохируулах хугацаа |
Зөвлөмж болгож буй хэрэглээ |
Параформальдегид (PFA) |
2-4% |
15-30 минут |
Эсийн гадаргуугийн тэмдэглэгээг хадгалахад тохиромжтой; иммунофенотипийн хувьд түгээмэл байдаг |
Этанол |
70-100% |
10-15 минут |
ДНХ-ийн агуулгын шинжилгээ, эсийн мөчлөгийн судалгаанд хамгийн тохиромжтой |
Метанол |
90-100% |
10-15 минут |
Эсийн доторх уургийн шинжилгээ хийхэд тохиромжтой; эсийн агшилтыг үүсгэж болно |
Формалин |
10% (формальдегид) |
Өөр өөр байдаг (эдээс хамаарна) |
Ерөнхийдөө бие даасан эсэд бус, тогтмол эд эсийн дээж авахад ашигладаг |
Урсгалын цитометрийн эсийг засах алхам алхмаар гарын авлага
Эсийн дээж бэлтгэх
Бэхэлгээ хийхийн өмнө эд эс эсвэл цусны дээжээс эсийг тусгаарлах шаардлагатай. Центрифуг нь суспенз дэх эсийг төвлөрүүлэхэд ашигладаг хамгийн түгээмэл арга юм. Мөн бэхлэх үйл явцад саад учруулж болох өсгөвөрлөгч болон үлдэгдэл бохирдуулагчийг зайлуулахын тулд эсийг сайтар угааж цэвэрлэх нь чухал юм.
1. Эсийн тусгаарлалт: Сонирхсон эсүүдийг салгахын тулд центрифуг эсвэл эсийг ангилах зэрэг тусгаарлах стандарт аргуудыг ашиглана.
2. Угаах: Эсийг фосфат буфержүүлсэн давсны уусмалаар (PBS) угаана.
Бэхэлгээний журам
Эсүүдийг бэлтгэсний дараа дараагийн алхам нь эсийн суспензэнд бэхлэгчийг нэмэх явдал юм. Урсгалын цитометрийн хувьд хамгийн түгээмэл хэрэглэгддэг бэхэлгээ нь 2-4% PFA уусмал юм.
1. Эсийн суспензэнд бэхлэгчийг нэмж, сайтар холилдсон эсэхийг шалгаарай.
2. Эсийг 2-8°С-т 15-30 минутын турш бэхлэгчээр өсгөвөрлөнө.
3. Инкубацийн дараа эсийг PBS-ээр 2 удаа угааж, илүүдэл бэхлэгчийг зайлуулна.
Бэхэлгээний дараах үе шатууд
Бэхэлгээ хийсний дараа эсийг болгоомжтой хийх хэрэгтэй. Хэрэв нэмэлт шинжилгээ хийх шаардлагатай бол шинжилгээ хийхээс өмнө эсийг будна. Хэрэв та эсийг ирээдүйд шинжилгээнд зориулж хадгалахаар төлөвлөж байгаа бол тэдгээрийг зохих буферт дахин түдгэлзүүлж, 2-8 хэмд хадгална. Хэт их бэхэлгээ нь автофлюресценцийг нэмэгдүүлж, дохионы чанарыг бууруулдаг тул эсийг бэхэлгээнд удаан хугацаагаар үлдээхээс зайлсхий.
Урсгалын цитометрийн оновчтой тогтоох зөвлөмжүүд
Хэт бэхэлгээнээс зайлсхийх
Эсүүд бэхэлгээний бодист удаан хугацаагаар өртөх үед хэт бэхэлгээ үүсдэг бөгөөд энэ нь эсийн уургуудыг хэт хольж, өгөгдлийн чанарыг алдагдуулж болзошгүй юм. Энэ нь автофлюоресценци, эсрэгбиеийн холболтыг багасгах, урсгалын цитометрийн хэмжилтийг буруу хийхэд хүргэж болно. Хэт бэхлэлтээс зайлсхийхийн тулд өөрийн эсийн төрөл, туршилтыг санал болгож буй бэхэлгээний хугацааг үргэлж шалгаж үзээрэй.
Засварлах хугацаа ба дээжийн төрөл
Хамгийн оновчтой бэхэлгээний хугацаа нь эсийн төрөл, туршилтын шинж чанараас хамаарч өөр өөр байж болно. Жишээлбэл, дархлааны эсүүд эд эсийн дээжээс богино хугацаанд бэхлэх шаардлагатай болдог. Дээжийн төрлийн тодорхой хэрэгцээнд үндэслэн бэхэлгээний хугацааг тохируулна уу. Гадаргуугийн уургийн шинжилгээнд ихэвчлэн богино бэхэлгээний хугацаа (10-15 минут) хангалттай байдаг. Эсийн доторх будалт эсвэл ДНХ-ийн шинжилгээнд илүү удаан бэхлэх хугацаа шаардагдана.
Бэхэлгээний дараа будах
Эсийг зассаны дараа эсрэгбие эсвэл флюресцент будагч бодисоор будах нь урсгалын цитометрийн шинжилгээний чухал алхам юм. Зарим флюресцент будагч бодисууд, ялангуяа тандем будагч бодисууд нь бэхэлгээнд мэдрэмтгий байдаг ба эсүүд хэт бэхлэгдсэн тохиолдолд муудаж болзошгүй. Будгийн оновчтой үр дүнд хүрэхийн тулд аль болох бэхлэхээс өмнө эсийг будахыг зөвлөж байна. Энэ нь будгийг задлахаас сэргийлж, илүү хүчтэй флюресценцийн дохиог хангахад тусална.
Урсгалын цитометрийн тогтмол эсүүдийг хадгалах
Богино хугацааны хадгалалт
Богино хугацаанд хадгалахын тулд суурин эсийг 2-8 хэмийн температурт хөргөгчинд хадгалж болно. Энэ нь бэхэлгээний дараа нэг эсвэл хоёр өдрийн дотор эсийг шинжлэхээр төлөвлөж байгаа тохиолдолд тохиромжтой. Флюресцент дохионд нөлөөлж болох гэрэл гэгээтэй цайруулахаас сэргийлэхийн тулд тогтмол эсийг үргэлж харанхуйд хадгал.
Урт хугацааны хадгалалт
Урт хугацаанд хадгалахын тулд эсийг крио хадгалах орчинд хөлдөөж болно. Ердийн крио хадгалах орчин нь 10% диметил сульфоксид (DMSO) ба 90% ургийн үхрийн ийлдэс (FBS) -аас бүрдэнэ. Гэсэн хэдий ч mFreSR™ эсвэл CryoStor™ CS10 зэрэг ийлдэсгүй крио хадгалах шийдлүүд бас байдаг бөгөөд FBS-тэй холбоотой асуудлаас зайлсхийхэд ашиглаж болно. Мөсөн талст үүсэхээс сэргийлэхийн тулд хяналттай хөлдөөгч ашиглан эсийг хөлдөөж болно. Энэ нь эсийн амьдрах чадварыг хадгалж, зохих ёсоор хадгалахад тусалдаг.
Урсгалын цитометрийн эсийг тогтооход зайлсхийх нийтлэг бэрхшээлүүд
Буруу бэхэлгээний үр дагавар
Буруу бэхэлгээ нь автофлуоресценци, эсрэгбиеийн холболт буурах, эсийн амьдрах чадвар муу зэрэг хэд хэдэн асуудалд хүргэдэг. Эдгээр асуудлууд нь урсгалын цитометрийн үр дүнгийн нарийвчлал, найдвартай байдалд ихээхэн нөлөөлдөг. Дээжийнхээ төрөлд зориулсан бэхэлгээний протоколуудыг үргэлж шалгаж, бэхэлгээний нөхцөл нь шинжилж буй эсийн төрөл болон тэмдэглэгээнд тохирсон эсэхийг шалгаарай.
Таны хэрэглээнд тохирох засах хэрэгслийг сонгох
Урсгалын цитометрийн туршилтанд тохирох бэхлэгчийг сонгох нь найдвартай, үнэн зөв үр дүнд хүрэхэд маш чухал юм. Төрөл бүрийн бэхэлгээ нь өөр өөр хэрэглээнд илүү тохиромжтой. Жишээлбэл, PFA нь гадаргуугийн уургийн шинжилгээнд ихэвчлэн хэрэглэгддэг бол этанол нь ДНХ-д суурилсан судалгаанд хамгийн тохиромжтой байдаг. Туршилтыг эхлүүлэхийн өмнө өөрийн хэрэглээнд тохирох хамгийн сайн бэхлэгчийг судалж, бэхэлгээний протоколыг тохируулна уу.
Байгуулах
Урсгалын цитометрийн шинжилгээг амжилттай хийхэд эсийн зөв бэхэлгээ нь чухал юм. Энэ нь эсийн бүтцийг хадгалахад тусалдаг ба уураг, ДНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлыг хангадаг. Зохих протоколыг дагаж, хэт засахаас зайлсхийснээр судлаачид мэдээллийн үнэн зөв, найдвартай байдлыг нэмэгдүүлэх боломжтой. Туршилтдаа тохирох бэхлэгчийг сонгох нь таны үр дүнгийн ерөнхий чанарыг сайжруулна. Эдгээр шилдэг туршлагыг хэрэгжүүлснээр таны урсгалын цитометрийн шинжилгээ нь эсийн үйл ажиллагааны талаар тууштай, давтагдах боломжтой ойлголтыг өгдөг.
Эсийн зөв бэхэлгээ нь урсгалын цитометрийн гол үүрэг гүйцэтгэдэг ба түүнээс авсан бүтээгдэхүүн HKeybio найдвартай шийдлүүдийг санал болгодог. Тэдний санал болгож буй бүтээгдэхүүнүүд нь өндөр чанарын үр дүнг баталгаажуулж, эсийн үнэн зөв шинжилгээнд дэлхийн өнцөг булан бүрээс судлаачид итгэдэг.
Түгээмэл асуултууд
Асуулт: Урсгалын цитометрт эсийн бэхэлгээний ач холбогдол юу вэ?
Хариулт: Урсгалын цитометрийн хувьд эсийн бэхэлгээ нь эсийн бүтцийг хадгалж, уураг болон ДНХ-ийн бүрэн бүтэн байдлыг хангаж, үнэн зөв дүн шинжилгээ хийхэд чухал үүрэгтэй.
А: Урсгалын цитометрийн хувьд эсийг хэр удаан засах ёстой вэ?
Хариулт: Эсийн бүрэн бүтэн байдлыг хадгалахын тулд эсийг ихэвчлэн 2-4% параформальдегидийн (PFA) уусмалаар 15-30 минутын турш бэхэлсэн байх ёстой.
Асуулт: Би урсгалын цитометрийн эсийг тогтооход этанол хэрэглэж болох уу?
Хариулт: Тийм ээ, этанол тогтоогчийг урсгалын цитометрийн ДНХ-ийн агуулгын шинжилгээнд, ялангуяа эсийн мөчлөгийн судалгаанд ихэвчлэн ашигладаг.
А: Урсгалын цитометрт эсүүд хэт тогтсон бол яах вэ?
Хариулт: Хэт бэхлэлт нь хэт их хөндлөн холбоос үүсгэж, автофлюресцент болон эсрэгбие муутай холбогдож, урсгалын цитометрийн үр дүнд нөлөөлж болзошгүй.
