Uvod
Ste se kdaj vprašali, kako pretočna citometrija dosega tako natančno in zanesljivo analizo celic? Ključ do natančnih rezultatov je pravilna fiksacija celic. Pretočna citometrija omogoča raziskovalcem preučevanje različnih celičnih značilnosti, od velikosti do intenzivnosti fluorescence. Vendar brez ustrezne fiksacije podatki morda ne bodo odražali resničnih celičnih lastnosti. V tem članku bomo raziskali pomen fiksacije celic v pretočni citometriji, razpravljali o različnih metodah fiksacije in delili nasvete za optimalne rezultate.
Kaj je fiksacija celic v pretočni citometriji?
Opredelitev fiksacije celic
Fiksacija celic je proces, ki stabilizira in ohrani celice s preprečevanjem sprememb v njihovi strukturi, funkciji in molekularni sestavi. Ta proces se doseže s kemičnim navzkrižnim povezovanjem beljakovin, lipidov in drugih celičnih komponent, s čimer se celice učinkovito 'zamrznejo' v njihovem trenutnem stanju. To je še posebej pomembno pri pretočni citometriji, ker preprečuje razgradnjo celičnih markerjev ali spremembo celičnih struktur med analizo. S fiksiranjem celic lahko raziskovalci zagotovijo, da lastnosti celic ostanejo dosledne, kar omogoča natančne meritve in zanesljive podatke med analizo s pretočno citometrijo.
Zakaj je fiksacija pomembna
Pravilna fiksacija je bistvena, ker ohranja celovitost celičnih proteinov in nukleinskih kislin, ki so ključne za natančno analizo s pretočno citometrijo. Če celice niso fiksirane, se lahko njihova struktura in molekularni markerji sčasoma poslabšajo ali spremenijo, kar povzroči nezanesljive in netočne rezultate. Fiksacija ima tudi ključno vlogo pri stabilizaciji celic za analizo z več parametri, kar je ena od ključnih prednosti pretočne citometrije. Raziskovalcem omogoča sočasno ocenjevanje več celičnih značilnosti, kot so površinski markerji, znotrajcelični proteini in vsebnost DNK, v enem poskusu. Brez ustrezne fiksacije so lahko dobljeni podatki nedosledni ali nepopolni, kar vodi v napačno razlago eksperimentalnih rezultatov.
Vrste fiksacijskih metod za pretočno citometrijo
Fiksacija s paraformaldehidom (PFA).
Paraformaldehid (PFA) je eden najpogosteje uporabljenih fiksativov v pretočni citometriji, predvsem zaradi njegove učinkovitosti pri ohranjanju celične morfologije in antigenosti. Deluje tako, da zamreži beljakovine v celicah, kar zagotavlja, da celična struktura in površinske beljakovine ostanejo nedotaknjene. Zaradi tega je PFA odlična izbira za ohranjanje markerjev celične površine, zlasti pri analizi izražanja površinskih beljakovin v poskusih imunofenotipizacije.
Priporočilo:
● Koncentracija: 2-4 % PFA se običajno uporablja za optimalno fiksacijo.
● Čas fiksacije: Celice je treba inkubirati v PFA 15-30 minut pri 2-8 °C.
● Shranjevanje: Po fiksaciji je treba celice shraniti pri 2-8 °C za kratkotrajno shranjevanje. Pomembno je, da nespremenljivih celic ne shranjujete dlje časa, saj lahko to povzroči izgubo celovitosti markerja.
Pomembno je, da se izognete prekomerni fiksaciji, saj lahko dolgotrajna izpostavljenost PFA povzroči celično avtofluorescenco in moti kasnejše barvanje in analizo. Za fiksacijo vedno uporabite minimalno potrebno količino časa.
Fiksacija etanola
Fiksacija z etanolom se običajno uporablja, kadar je analiza osredotočena na vsebnost DNK, na primer pri študijah celičnega cikla. Etanol je dehidracijsko sredstvo, ki deluje tako, da prodre skozi celično membrano in ohrani DNK v celicah. Zaradi tega je fiksacija z etanolom še posebej uporabna za analize na osnovi DNK in analize s pretočno citometrijo, kjer se pregledujejo stopnje celičnega cikla ali vsebnost DNK.
Priporočilo:
● Koncentracija: Običajno se uporablja 70-100 % etanol.
● Čas fiksacije: Fiksacija z etanolom običajno zahteva 10-15 minut za optimalne rezultate.
Fiksacija z etanolom je idealna za ohranjanje faz celičnega cikla in se lahko uporablja v kombinaciji z barvili, ki vežejo DNK, kot je propidijev jodid (PI), za analizo celičnega cikla.
Fiksacija metanola
Metanol je še en pogosto uporabljen fiksativ, zlasti za znotrajcelične analize. Deluje tako, da prodre skozi celično membrano in stabilizira notranje strukture celice. Medtem ko je metanol učinkovit pri ohranjanju celičnih beljakovin in antigenov, lahko povzroči krčenje celic, kar lahko vpliva na interpretacijo določenih značilnosti, kot sta velikost in morfologija celic.
Priporočilo:
● Koncentracija: Običajno se uporablja 90-100 % metanol.
● Čas fiksiranja: običajno zadostuje 10-15 minut.
Fiksacija z metanolom se pogosto uporablja pri preučevanju znotrajceličnih proteinov, zlasti pri pregledu markerjev znotraj citoplazme ali jedra. Vendar pa bi morali raziskovalci upoštevati potencial za krčenje celic pri uporabi fiksacije z metanolom.
Drugi fiksativi (npr. Formalin)
Formalin, raztopina formaldehida v vodi, je še en fiksativ, ki se uporablja v pretočni citometriji, čeprav je manj pogost kot PFA. Formalin se pogosto uporablja v histologiji in imunohistokemiji, kjer učinkovito ohranja vzorce tkiva za mikroskopsko analizo. Čeprav formalin lahko ohrani celične strukture, ga na splošno ne priporočamo za pretočno citometrijo, razen če delamo s fiksnimi vzorci tkiva, saj lahko moti razvrščanje celic in nekatere fluorescenčne aplikacije. Formalinska fiksacija je najbolj primerna za vzorce tkiva, ne za posamezne celice.
Fiksativ |
koncentracija |
Čas fiksiranja |
Priporočena uporaba |
paraformaldehid (PFA) |
2-4 % |
15-30 minut |
Idealno za ohranjanje markerjev celične površine; običajno za imunofenotipizacijo |
Etanol |
70-100 % |
10-15 minut |
Najboljše za analizo vsebine DNK in študije celičnega cikla |
Metanol |
90-100 % |
10-15 minut |
Primerno za znotrajcelično analizo beljakovin; lahko povzroči krčenje celic |
Formalin |
10% (formaldehid) |
Različno (odvisno od tkiva) |
Na splošno se uporablja za fiksne vzorce tkiv, ne za posamezne celice |
Vodnik po korakih za fiksiranje celic za pretočno citometrijo
Priprava vzorca celice
Pred fiksacijo je nujno, da izoliramo celice iz vzorca tkiva ali krvi. Centrifugiranje je najpogostejša metoda, ki se uporablja za koncentriranje celic v suspenziji. Ključnega pomena je tudi, da celice temeljito operete, da odstranite morebitna gojišča ali ostanke kontaminantov, ki bi lahko motili postopek fiksacije.
1. Izolacija celic: Uporabite standardne metode izolacije, kot je centrifugiranje ali razvrščanje celic, da ločite celice, ki vas zanimajo.
2. Pranje: celice sperite s fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS), da odstranite ostanke medijev in kontaminantov, ki bi lahko vplivali na postopek fiksacije.
Postopek pritrditve
Ko so celice pripravljene, je naslednji korak dodajanje fiksativa celični suspenziji. Najpogosteje uporabljen fiksativ za pretočno citometrijo je 2-4 % raztopina PFA.
1. Dodajte fiksativ celični suspenziji in se prepričajte, da je dobro premešana.
2. Inkubirajte celice s fiksativom 15-30 minut pri 2-8°C.
3. Po inkubaciji celice dvakrat sperite s PBS, da odstranite odvečni fiksativ.
Koraki po fiksaciji
Po fiksaciji je treba s celicami ravnati previdno. Če je potrebna nadaljnja analiza, je treba celice pred analizo obarvati. Če nameravate celice shraniti za prihodnjo analizo, jih resuspendirajte v ustreznem pufru in shranite pri 2–8 °C. Izogibajte se puščanju celic v fiksativu za daljša obdobja, saj lahko prekomerna fiksacija povzroči povečano avtofluorescenco in zmanjšano kakovost signala.
Nasveti za optimalno fiksacijo pri pretočni citometriji
Izogibanje pretirani fiksaciji
Do prekomerne fiksacije pride, ko so celice predolgo izpostavljene fiksativu, kar lahko povzroči prekomerno navzkrižno povezovanje celičnih proteinov in ogrozi kakovost podatkov. To lahko privede do avtofluorescence, zmanjšane vezave protiteles in netočnih meritev pretočne citometrije. Vedno preverite priporočene čase fiksacije za vaš specifični tip celice in eksperimentirajte, da preprečite prekomerno fiksacijo.
Čas fiksacije v primerjavi z vrsto vzorca
Optimalni čas fiksacije se lahko razlikuje glede na vrsto celice in naravo poskusa. Na primer, imunske celice lahko zahtevajo krajše čase fiksacije kot vzorci tkiva. Prilagodite čas fiksiranja glede na posebne potrebe vrste vzorca. Za površinsko analizo beljakovin običajno zadostuje krajši čas fiksacije (10-15 minut). Za znotrajcelično obarvanje ali analizo DNK bo morda potreben daljši čas fiksacije.
Barvanje po fiksaciji
Po fiksaciji celic je obarvanje s protitelesi ali fluorescenčnimi barvili kritičen korak v analizi s pretočno citometrijo. Nekatera fluorescentna barvila, zlasti tandemska barvila, so lahko občutljiva na fiksacijo in se lahko razgradijo, če so celice preveč fiksirane. Za optimalne rezultate obarvanja je priporočljivo, da celice obarvate pred fiksacijo, kadar koli je to mogoče. To lahko pomaga preprečiti razgradnjo barvila in zagotoviti močnejše fluorescenčne signale.
Shranjevanje fiksnih celic za pretočno citometrijo
Kratkoročno shranjevanje
Za kratkotrajno shranjevanje lahko fiksne celice shranite v hladilniku pri 2-8°C. To je idealno, če nameravate celice analizirati v dnevu ali dveh po fiksaciji. Fiksne celice vedno shranjujte v temi, da preprečite fotobeljenje, ki lahko vpliva na fluorescentne signale.
Dolgotrajno shranjevanje
Za dolgotrajno shranjevanje lahko celice zamrznemo v mediju za kriokonzervacijo. Tipičen medij za kriokonzervacijo je sestavljen iz 10 % dimetil sulfoksida (DMSO) in 90 % fetalnega govejega seruma (FBS). Na voljo pa so tudi raztopine za kriokonzervacijo brez seruma, kot sta mFreSR™ ali CryoStor™ CS10, ki se lahko uporabljajo za izogibanje težavam, povezanim s FBS. Če želite preprečiti nastajanje ledenih kristalov, za zamrzovanje celic uporabite zamrzovalnik z nadzorovano hitrostjo. To pomaga ohranjati sposobnost preživetja celic in zagotavlja pravilno shranjevanje.
Pogoste pasti, ki se jim je treba izogniti pri fiksaciji celic za pretočno citometrijo
Učinki nepravilne fiksacije
Nepravilna fiksacija lahko povzroči več težav, vključno z avtofluorescenco, zmanjšano vezavo protiteles in slabo sposobnostjo preživetja celic. Te težave lahko pomembno vplivajo na točnost in zanesljivost rezultatov pretočne citometrije. Vedno preverite protokole fiksacije za vaš specifični tip vzorca in zagotovite, da so pogoji fiksacije primerni za vrsto celice in markerje, ki jih analizirate.
Izbira pravega fiksativa za vašo aplikacijo
Izbira ustreznega fiksativa za vaš poskus s pretočno citometrijo je ključnega pomena za pridobitev zanesljivih in natančnih rezultatov. Različni fiksativi so bolj primerni za različne aplikacije. Na primer, PFA se običajno uporablja za analizo površinskih beljakovin, medtem ko je etanol idealen za študije, ki temeljijo na DNK. Preden začnete s poskusom, raziščite najboljši fiksativ za vašo posebno uporabo in temu prilagodite protokol fiksacije.
Zaključek
Pravilna fiksacija celic je bistvena za doseganje uspešne analize s pretočno citometrijo. Pomaga ohranjati celične strukture in zagotavlja celovitost beljakovin in DNK. Z upoštevanjem ustreznih protokolov fiksiranja in izogibanjem prekomernemu fiksiranju lahko raziskovalci povečajo točnost in zanesljivost podatkov. Izbira ustreznega fiksativa za vaš poskus izboljša splošno kakovost vaših rezultatov. Izvajanje teh najboljših praks zagotavlja, da vaša analiza pretočne citometrije zagotavlja dosleden, ponovljiv vpogled v celične funkcije.
Pravilna fiksacija celic ima ključno vlogo pri pretočni citometriji in izdelkih iz HKeybio ponuja zanesljive rešitve. Njihova ponudba zagotavlja visokokakovostne rezultate in raziskovalci po vsem svetu jim zaupajo natančno analizo celic.
pogosta vprašanja
V: Kakšen je pomen fiksacije celic pri pretočni citometriji?
O: Fiksacija celic je ključnega pomena pri pretočni citometriji, saj ohranja celične strukture in zagotavlja celovitost beljakovin in DNK za natančno analizo.
V: Kako dolgo naj bodo celice fiksirane za pretočno citometrijo?
O: Celice je treba običajno fiksirati 15-30 minut z 2-4-odstotno raztopino paraformaldehida (PFA), da ohranimo celično celovitost.
V: Ali lahko uporabim etanol za fiksacijo celic pri pretočni citometriji?
O: Da, fiksacija z etanolom se običajno uporablja za analizo vsebnosti DNK v pretočni citometriji, zlasti za študije celičnega cikla.
V: Kaj se zgodi, če so celice v pretočni citometriji preveč fiksirane?
O: Prekomerna fiksacija lahko povzroči čezmerno navzkrižno povezovanje, kar povzroči avtofluorescenco in slabo vezavo protiteles, kar lahko vpliva na rezultate pretočne citometrije.
