Ինչպես է աշխատում հոսքի ցիտոմետրիան

Ներածություն

Երբևէ մտածե՞լ եք, թե ինչպես են հետազոտողները վերլուծում հազարավոր բջիջներ ընդամենը մի քանի րոպեում: Flow Cytometry-ն դա հնարավոր է դարձնում: Այս տեխնիկան առաջարկում է առանձին բջիջների արագ, բազմաչափ վերլուծություն՝ բացահայտելով դրանց ֆիզիկական և քիմիական հատկությունների կարևորագույն պատկերացումները:

 

Այս հոդվածում մենք կուսումնասիրենք հոսքի ցիտոմետրիայի ներքին աշխատանքը՝ սկսած նմուշի պատրաստումից մինչև վերջնական տվյալների վերլուծություն: Դուք ավելի խորը պատկերացում կստանաք, թե ինչպես է այս հզոր գործիքը փոխակերպել գիտական ​​հետազոտությունները և կլինիկական կիրառությունները այնպիսի ոլորտներում, ինչպիսիք են իմունոլոգիան, քաղցկեղի հետազոտությունը և այլն:

Հոսքի ցիտոմետրիայի հիմնական սկզբունքները

Հեղուկային համակարգ

Հոսքի ցիտոմետրիան սկսվում է հեղուկների համակարգից, որտեղ բջիջներ կամ մասնիկներ պարունակող նմուշը կասեցվում է հեղուկ լուծույթում և ներմուծվում հոսքի ցիտոմետր: Համակարգն օգտագործում է պատյանային հեղուկ, որը շրջապատում է նմուշը և ապահովում, որ բջիջները հավասարեցվեն մեկ ֆայլի մեջ: Սա ապահովում է, որ բջիջները մեկ առ մեկ վերլուծվեն, երբ նրանք անցնում են լազերային ճառագայթով: Ֆլյուիդիկայի համակարգը պատասխանատու է գործիքի ներսում բջիջների ճշգրիտ շարժման և կազմակերպման համար, ինչը չափազանց կարևոր է վերլուծության գործընթացում ճշգրիտ չափումներ ապահովելու համար: Առանց լավ գործող հեղուկային համակարգի, անհնար կլիներ պահպանել այն բարձր ճշգրտությունն ու արագությունը, որով հայտնի է հոսքի ցիտոմետրիան: Համակարգի կարողությունը կենտրոնացնել բջիջները մեկ ֆայլի հոսքի մեջ, թույլ է տալիս մանրամասն, մեկ բջջի վերլուծություն, ինչը կարևոր է առանձին բջիջների վարքագիծն ու բնութագրերը հասկանալու համար:

 

Լույսի ցրում և լյումինեսցենտ

Հաջորդ հիմնական սկզբունքը հոսքի ցիտոմետրիայում ներառում է, թե ինչպես են բջիջները փոխազդում լույսի հետ: Առջևի ցրումը (FSC) չափում է բջջի չափը, մինչդեռ կողային ցրումը (SSC) չափում է ներքին բարդությունը, օրինակ՝ հատիկավորությունը կամ բջջի կառուցվածքը: Այս երկու ցրման պարամետրերը միասին ապահովում են բջջի ֆիզիկական կառուցվածքի մասին հիմնարար տեղեկատվություն:

 

Բացի այդ, ֆլուորեսցենցիան վճռորոշ դեր է խաղում բջիջների ներսում հատուկ մարկերների կամ մոլեկուլների նույնականացման գործում: Երբ բջիջները պիտակավորված են լյումինեսցենտային պիտակներով, նրանք լազերների ազդեցության տակ լույս են արձակում տարբեր ալիքի երկարությամբ: Այս ֆլուորեսցենտային արտանետումը մանրամասն տեղեկատվություն է տալիս բջջի ներսում հատուկ սպիտակուցների, նուկլեինաթթուների կամ այլ մոլեկուլների առկայության մասին: Լույսի ցրման և լյումինեսցենցիայի համադրությունը թույլ է տալիս բջիջների բազմաչափ վերլուծություն իրականացնել՝ հնարավորություն տալով հետազոտողներին ավելի խորը պատկերացում կազմել դրանց հատկությունների մասին:

 

Դետեկտորներ և ազդանշանների մշակում

Երբ բջիջները անցնում են լազերային միջով, լույսի ցրումը և լյումինեսցենտային ազդանշանները հայտնաբերվում են բարդ դետեկտորների միջոցով, ինչպիսիք են ֆոտոդիոդները կամ ֆոտոբազմապատկիչ խողովակները: Այս դետեկտորները գրավում են արձակված ազդանշանները և դրանք վերածում թվային տվյալների: Այնուհետև այս տվյալները մշակվում են համակարգչի կողմից՝ թույլ տալով հետազոտողներին վերլուծել և մեկնաբանել բջիջների բնութագրերը: Ստացված տվյալները կարող են վիզուալացվել տարբեր ձևաչափերով, ինչպիսիք են հիստոգրամները, կետային սյուժեները կամ ավելի առաջադեմ տեխնիկան՝ կախված փորձի բարդությունից:

 

Դետեկտորների ճշգրտությունն ու զգայունությունը կարևոր են համոզվելու համար, որ ստացված տվյալները արտացոլում են վերլուծվող բջիջների իրական հատկությունները: Դետեկտորների տեխնոլոգիայի առաջընթացի շնորհիվ հոսքի ցիտոմետրիան էլ ավելի հզոր է դարձել, ինչը թույլ է տալիս միաժամանակ հայտնաբերել բազմաթիվ պարամետրեր՝ ավելի մեծացնելով տեխնիկայի հնարավորությունները:

 

Պարամետր	Չափում	Նպատակը
Առջևի ցրում (FSC)	Լույսը ցրված է առաջ ուղղությամբ	Չափում է բջիջների չափը
Կողքի ցրում (SSC)	Լույսը ցրված է 90°-ով	Չափում է ներքին բարդությունը կամ հատիկավորությունը
Լյումինեսցենտ	Ֆտորոֆորներից արտանետվող լույս	Հայտնաբերում է հատուկ մարկերներ կամ սպիտակուցներ բջիջների ներսում/դրսում

 

Լազերների դերը հոսքի ցիտոմետրիայում

Լազերային տեսակները և գործառույթները

Հոսքային ցիտոմետրիայում լազերները կարևոր են բջիջներին կցված ֆլուորեսցենտային մարկերները գրգռելու համար: Ժամանակակից հոսքի ցիտոմետրերը սովորաբար օգտագործում են բազմաթիվ լազերներ՝ տարբեր ֆտորոֆորներ գրգռելու համար: Յուրաքանչյուր լազեր կարգավորվում է որոշակի ալիքի երկարությամբ, որն ակտիվացնում է բջիջներին կցված լյումինեսցենտային ներկերը կամ սպիտակուցները: Բազմաթիվ լազերներ օգտագործելու այս ունակությունը թույլ է տալիս մեկ բջջի վրա մի քանի պարամետրերի համապարփակ վերլուծություն կատարել՝ հոսքի ցիտոմետրիան անգնահատելի գործիք դարձնելով բարդ փորձերի համար: Լազերների օգտագործումը հոսքի ցիտոմետրիայում այն ​​է, ինչը հետազոտողներին հնարավորություն է տալիս միանգամից հազարավոր բջիջների բարձր թողունակության վերլուծություն կատարել: Լազերները ոչ միայն գրգռում են լյումինեսցենտային մարկերները, այլև ապահովում են լույսը, որն անհրաժեշտ է բջիջների չափը և ներքին բարդությունը չափելու համար լույսի ցրման միջոցով: Սա լազերները դարձնում է տեխնիկայի հիմնաքարը:

 

Լազերային տեսակ	Ալիքի երկարություն	Գործառույթ	Հուզված ֆտորոֆորներ
Կապույտ լազեր	488 նմ	Գրգռում է կանաչ ֆտորոֆորները	FITC, GFP
Կարմիր լազեր	633 նմ	Հուզում է հեռավոր կարմիր ֆտորոֆորներին	APC, Alexa Fluor 647
Վիոլետ լազեր	405 նմ	Գրգռում է մանուշակագույն և ուլտրամանուշակագույն ֆտորոֆորները	DAPI, Խաղաղ օվկիանոսի կապույտ

 

Լազերային փոխազդեցություն բջիջների հետ

Երբ բջիջները անցնում են լազերային ճառագայթով, լույսի ցրումը տեղի է ունենում տարբեր ուղղություններով: Առջևի ցրումը չափում է լազերային ճառագայթի ուղղությամբ ցրված լույսի քանակը՝ տեղեկատվություն տրամադրելով բջջի չափի մասին: Կողային ցրումը, որը չափվում է լազերի նկատմամբ 90 աստիճանի անկյան տակ, չափում է բջջի ներքին կառուցվածքներից ցրված լույսի քանակը՝ հնարավորություն տալով պատկերացում կազմել դրա ներքին բարդության մասին: Բացի ցրումից, բջիջներին կցված լյումինեսցենտային մարկերները լույս են արձակում որոշակի ալիքի երկարություններով, երբ գրգռվում են լազերի կողմից: Այս արտանետվող լույսը գրավվում է դետեկտորների կողմից և օգտագործվում է բջջի մակերեսին կամ բջջի ներսում հատուկ մարկերների կամ սպիտակուցների առկայությունը չափելու համար: Լույսի ցրման և ֆլյուորեսցենցիայի համադրությունն այն է, ինչը թույլ է տալիս բջիջների նման մանրամասն վերլուծություն իրականացնել հոսքի ցիտոմետրիայում:

 

Նմուշի պատրաստում հոսքի ցիտոմետրիայի համար

Բջջային պիտակավորում լյումինեսցենտային ներկերով

Ֆլոքսիտոմետրիայի վերլուծության համար բջիջները նախ պետք է պիտակավորված լինեն լյումինեսցենտային ներկերով կամ հակամարմիններով: Այս պիտակները կապվում են բջջի մակերեսի կամ բջջի ներսում հատուկ սպիտակուցների կամ մարկերների հետ, ինչը թույլ է տալիս դրանք հայտնաբերել և չափել վերլուծության գործընթացում: Հոսքի ցիտոմետրիայում օգտագործվող ընդհանուր մարկերները ներառում են ԴՆԹ կապող ներկեր, որոնք կարող են գնահատել բջիջների կենսունակությունը և առողջությունը, և ֆլյուորեսցենտային կոնյուգացված հակամարմինները, որոնք թիրախավորում են բջջի մակերեսին հատուկ սպիտակուցներ: Օրինակ, հետազոտողները կարող են պիտակավորել իմունային բջիջները հատուկ մակերեսային մարկերների դեմ հակամարմիններով՝ վերլուծելու իմունային պատասխանները կամ հիվանդության առաջընթացը:

 

Հիդրոդինամիկական կենտրոնացում

Հոսքի ցիտոմետրիայի կարևոր քայլը հիդրոդինամիկ ֆոկուսումն է, որտեղ հեղուկային համակարգը ստիպում է բջիջների կախոցը նեղ հոսքի մեջ մտնել՝ ապահովելով, որ բջիջները մեկ առ մեկ անցնեն լազերային միջով: Այս տեխնիկան ապահովում է, որ յուրաքանչյուր բջիջ վերլուծվի առանձին, ինչը շատ կարևոր է ճշգրիտ տվյալներ ստանալու համար: Հիդրոդինամիկ ֆոկուսավորումը թույլ է տալիս տարանջատել բջիջները նմուշում, այնպես որ դրանք կարող են վերլուծվել առանց հարևան բջիջների միջամտության: Հիդրոդինամիկ ֆոկուսումը հիմնական գործոններից մեկն է, որը տարբերում է հոսքի ցիտոմետրիան այլ մեթոդներից, ինչպիսիք են մանրադիտակը, որը կարող է ի վիճակի չլինել վերլուծել բջիջների մեծ պոպուլյացիաները այնքան արագ և արդյունավետ:

 

Տվյալների հավաքագրում և վերլուծություն

Gating և տվյալների վիզուալիզացիա

Երբ տվյալները հավաքագրվում են հոսքի ցիտոմետրից, մուտքային տեխնիկան օգտագործվում է բջիջների հատուկ պոպուլյացիաները զտելու և պատկերացնելու համար: Տվյալները ցուցադրելու համար սովորաբար օգտագործվում են ավանդական մեթոդներ, ինչպիսիք են հիստոգրամները և կետային սյուժեները: Այս վիզուալիզացիաները հետազոտողներին թույլ են տալիս խմբավորել բջիջները՝ հիմնվելով այնպիսի բնութագրերի վրա, ինչպիսիք են չափը, հատիկավորությունը և լյումինեսցենտությունը: Ավելի նոր մեթոդներ, ինչպիսիք են՝ PCA (հիմնական բաղադրիչի վերլուծություն), SPADE (Խտության-նորմալացված իրադարձությունների տարածվող ծառի առաջընթացի վերլուծություն) և tSNE (t-Distributed Stochastic Neighbor) տվյալների հավաքածուն օգտագործվում են: Այս առաջադեմ ալգորիթմները թույլ են տալիս հետազոտողներին բացահայտել նուրբ օրինաչափությունները մեծ տվյալների հավաքածուներում և կորզել իմաստալից կենսաբանական պատկերացումներ:

 

Բազմապարամետրային վերլուծություն

Հոսքային ցիտոմետրիայի ամենամեծ ուժեղ կողմերից մեկը միաժամանակ բազմաթիվ պարամետրեր չափելու նրա կարողությունն է: Այս հնարավորությունը թույլ է տալիս մանրակրկիտ վերլուծել բջիջները, օրինակ՝ չափել դրանց չափը, սպիտակուցի արտահայտվածությունը և կենսունակությունը մեկ փորձի ընթացքում: Flow cytometry-ն կարող է չափել մինչև 30 պարամետր մեկ բջջում, ինչը այն դարձնում է իդեալական բարդ բջիջների պոպուլյացիաների ուսումնասիրման համար, ինչպիսիք են քաղցկեղի կամ իմունային պատասխանների դեպքում: Բազմակի պարամետրային վերլուծությունը կարևոր է տարասեռ պոպուլյացիաների ուսումնասիրության համար, որտեղ բջիջները կարող են տարբեր լինել շատ առումներով: Մեկ բջջի վրա միաժամանակ մի քանի բնութագրեր չափելու այս ունակությունը հետազոտողներին տալիս է ուսումնասիրվող բջիջների պոպուլյացիայի ավելի ամբողջական պատկերը:

 

Flow Cytometry-ի կիրառությունները

Իմունոֆենոտիպավորում

Հոսքային ցիտոմետրիայի ամենատարածված կիրառություններից մեկը իմունոֆենոտիպավորումն է, որը ներառում է իմունային բջիջների վերլուծություն՝ հիմնվելով դրանց մակերեսային մարկերների վրա: Flow cytometry-ն կարող է միաժամանակ չափել մի քանի տարբեր մարկերներ իմունային բջիջների վրա՝ թույլ տալով հետազոտողներին դասակարգել բջիջների տեսակները, բացահայտել իմունային պատասխանները և վերահսկել հիվանդության առաջընթացը: Այն լայնորեն օգտագործվում է իմունային անբավարարությունների, լեյկեմիայի, լիմֆոմայի և իմունային հետ կապված այլ պայմանների ախտորոշման համար: Իմունոֆենոտիպավորումը դարձել է հետազոտության և կլինիկական պրակտիկայի կարևոր գործիք՝ իմունային համակարգի գործառույթը հասկանալու և բջջային աննորմալությունները բացահայտելու համար:

 

Քաղցկեղի հետազոտություն

Հոսքի ցիտոմետրիան վճռորոշ դեր է խաղում քաղցկեղի հետազոտության մեջ, մասնավորապես՝ քաղցկեղի բջիջների կենսաբանությունը հասկանալու համար: Այն թույլ է տալիս հետազոտողներին ուսումնասիրել բջիջների ԴՆԹ պարունակությունը, հայտնաբերել ուռուցքային մարկերներ և չափել բջիջների տարածման արագությունը: Օգտագործելով հոսքի ցիտոմետրիա՝ գիտնականները կարող են հետևել, թե ինչպես են քաղցկեղային բջիջները արձագանքում բուժմանը, գնահատել ուռուցքների ագրեսիվությունը և հայտնաբերել նոր բուժական թիրախներ:

 

Մանրէաբանական և արյունաբանական ուսումնասիրություններ

Բացի մարդկային բջիջների ուսումնասիրությունից, հոսքի ցիտոմետրիան լայնորեն կիրառվում է նաև մանրէաբանական հետազոտություններում՝ բակտերիաների, վիրուսների և այլ պաթոգենների ուսումնասիրության համար: Այն կարող է նույնականացնել մանրէները՝ հիմնվելով նրանց յուրահատուկ հատկությունների վրա, ինչպիսիք են չափը, ձևը և սպիտակուցի արտահայտումը: Արյունաբանության մեջ հոսքային ցիտոմետրիան օգտագործվում է արյան բջիջները ուսումնասիրելու, արյան հաշվարկի աննորմալությունները հայտնաբերելու և այնպիսի հիվանդությունների ախտորոշման համար, ինչպիսիք են անեմիան և լեյկոզը:

 

Դիմում	Դաշտ	Նպատակը
Իմունոֆենոտիպավորում	Իմունոլոգիա	Իմունային բջիջների դասակարգում, իմունային հիվանդությունների ախտորոշում
Քաղցկեղի հետազոտություն	Ուռուցքաբանություն	Քաղցկեղի բջիջների կենսաբանության ուսումնասիրություն, ուռուցքային մարկերների հայտնաբերում, բուժման արձագանքների մոնիտորինգ
Մանրէաբանական անալիզ	Մանրէաբանություն	Ֆիզիկական հատկությունների հիման վրա պաթոգենների հայտնաբերում և վերլուծություն
Արյունաբանություն	Արյունաբանություն	Արյան բջիջների պոպուլյացիաների ուսումնասիրություն, արյան հետ կապված հիվանդությունների ախտորոշում

 

ապագանFlow Cytometry-ի

Տեխնոլոգիաների առաջընթաց

Հոսքային ցիտոմետրիայի ոլորտը զարգանում է արագ տեմպերով, նոր տեխնոլոգիաները մեծացնում են դրա հնարավորությունները: Բարձր թողունակության համակարգերը թույլ են տալիս վերլուծել հազարավոր բջիջներ մի քանի վայրկյանում, մինչդեռ բազմալազերային կոնֆիգուրացիան մեծացնում է հայտնաբերվող պարամետրերի քանակը՝ բարելավելով փորձերի շրջանակն ու մանրամասնությունը: Պատկերային հոսքի ցիտոմետրիայի ինտեգրումը, որը համատեղում է ավանդական հոսքի ցիտոմետրիան մանրադիտակի հետ, թույլ է տալիս հետազոտողներին ստանալ բջիջների մանրամասն պատկերներ՝ բազմապարամետրային տվյալների հետ միասին: Այս տեխնոլոգիական առաջընթացն ավելի հզոր է դարձնում հոսքի ցիտոմետրիան՝ հնարավորություն տալով հետազոտողներին կատարել ավելի բարդ վերլուծություններ և ավելի խորը պատկերացում կազմել բջջի կենսաբանության վերաբերյալ:

 

Ծրագրերի ընդլայնում

Քանի որ հոսքի ցիտոմետրիան շարունակում է զարգանալ, դրա կիրառությունները ընդլայնվում են նոր ոլորտներում, ինչպիսիք են անհատականացված բժշկությունը, իմունոթերապիան և հազվագյուտ բջիջների հայտնաբերումը: Բջջային մարկերների և հատկությունների լայն տեսականի վերլուծելու կարողությունը հոսքի ցիտոմետրիան անփոխարինելի գործիք է դարձնում բազմաթիվ ոլորտների հետազոտողների համար՝ սկսած քաղցկեղի բուժումից մինչև վարակիչ հիվանդությունների մոնիտորինգ:

 

Եզրակացություն

Flow cytometry-ն կենսական գործիք է ժամանակակից կենսաբանական հետազոտություններում, որն աննախադեպ արագությամբ առաջարկում է պատկերացումներ առանձին բջիջների հատկությունների և վարքագծի վերաբերյալ: Քաղցկեղի հետազոտությունից մինչև իմունոլոգիա, դրա կիրառությունները հսկայական են և բազմազան: Քանի որ տեխնոլոգիան շարունակում է զարգանալ, այս տեխնիկայի ճշգրտությունն ու կիրառությունները շարունակում են աճել՝ այն դարձնելով գիտական ​​և բժշկական հետազոտությունների հիմնական ակտիվը: Իր արագ էվոլյուցիայի հետ մեկտեղ հոսքի ցիտոմետրիան, անկասկած, կմնա կենսաբանական բացահայտումների և կլինիկական ախտորոշման առաջատար դիրքերում:

 

Նման ընկերությունների համար HKeybio-ն , որն առաջարկում է առաջադեմ հոսքային ցիտոմետրիայի լուծումներ, այս տեխնոլոգիան կարող է արժեքավոր պատկերացումներ տալ բջիջների վարքագծի վերաբերյալ և պարզեցնել հետազոտական ​​ջանքերը: Նրանց արտադրանքը բերում է յուրահատուկ առավելություններ՝ զգալիորեն նպաստելով կենսաբանական և կլինիկական հետազոտությունների արագ առաջընթացին:

 

ՀՏՀ

Հարց: Ի՞նչ է հոսքի ցիտոմետրիան:

Flow cytometry-ն տեխնոլոգիա է, որն օգտագործվում է բջիջների ֆիզիկական և քիմիական հատկությունները վերլուծելու և չափելու համար: Այն աշխատում է հեղուկ հոսքի մեջ բջիջները կասեցնելով, դրանք լազերների միջով անցնելով և լույսի ցրվածությունն ու ֆլուորեսցենտությունը չափելով։

Հարց. Ինչպե՞ս է գործում հոսքի ցիտոմետրիան:

Հոսքի ցիտոմետրիան օգտագործում է լազերներ՝ բջիջները անհատապես վերլուծելու համար՝ հիմնվելով դրանց չափի, ներքին բարդության և լյումինեսցենտային մարկերների վրա: Հայտնաբերված ազդանշանները վերածվում են տվյալների՝ վերլուծության համար:

Հարց: Որո՞նք են հոսքի ցիտոմետրիայի հիմնական կիրառությունները:

Հոսքի ցիտոմետրիան օգտագործվում է իմունաբանության, քաղցկեղի հետազոտության, մանրէաբանության և արյունաբանության մեջ՝ տարբեր բնութագրերի հիման վրա բջիջները վերլուծելու և տեսակավորելու համար:

Հարց. Ինչու՞ է Flow Cytometry-ն կարևոր հետազոտության մեջ:

Flow cytometry-ն ապահովում է բարձր արագությամբ, բազմապարամետրային տվյալներ՝ հնարավորություն տալով արագ վերլուծել բջիջների մեծ պոպուլյացիաները, ինչը կարևոր է գիտական ​​և բժշկական հետազոտությունների համար:

Հարց: Որքանո՞վ է ճշգրիտ Flow Cytometry-ը:

Հոսքի ցիտոմետրիան շատ ճշգրիտ է, քանի որ այն կարող է արագ և ճշգրիտ չափել առանձին բջիջների բազմաթիվ պարամետրեր՝ ապահովելով հուսալի տվյալներ հետազոտության և ախտորոշման համար: