እንዴት እንደሆነ አስበህ ታውቃለህ ፍሰት ሳይቶሜትሪ እንደዚህ አይነት ትክክለኛ እና አስተማማኝ የሕዋስ ትንተና ያገኛል? ለትክክለኛው ውጤት ቁልፉ በትክክለኛው ሕዋስ ማስተካከል ላይ ነው. ፍሰት ሳይቶሜትሪ ተመራማሪዎች ከመጠኑ እስከ ፍሎረሰንት ጥንካሬ ድረስ የተለያዩ ሴሉላር ባህሪያትን እንዲያጠኑ ያስችላቸዋል። ነገር ግን፣ ተገቢው ጥገና ከሌለው መረጃው እውነተኛ ሴሉላር ንብረቶችን ላያንጸባርቅ ይችላል። በዚህ ጽሑፍ ውስጥ የሕዋስ ጥገናን በፍሰት ሳይቶሜትሪ ውስጥ ያለውን ጠቀሜታ እንመረምራለን ፣ የተለያዩ የማስተካከያ ዘዴዎችን እንነጋገራለን እና ለተሻለ ውጤት ጠቃሚ ምክሮችን እንካፈላለን ።
የሕዋስ ማስተካከል ሂደት፣ አወቃቀራቸው፣ ተግባራቸው እና ሞለኪውላዊ ውህደታቸው ላይ ለውጥን በመከላከል ሴሎችን የሚያረጋጋ እና የሚጠብቅ ሂደት ነው። ይህ ሂደት የሚገኘው በኬሚካላዊ ተያያዥነት ባላቸው ፕሮቲኖች፣ ቅባቶች እና ሌሎች ሴሉላር ክፍሎች አማካኝነት ሴሎችን አሁን ባሉበት ሁኔታ 'በቀዝቃዛ' ውጤታማ በሆነ መንገድ ነው። ይህ በተለይ በፍሰት ሳይቶሜትሪ ውስጥ በጣም አስፈላጊ ነው, ምክንያቱም በመተንተን ወቅት የሴሉላር ጠቋሚዎችን መበላሸት ወይም የሴሉላር መዋቅሮችን መለወጥ ይከላከላል. ሴሎቹን በማስተካከል ተመራማሪዎች የሴሎች ባህሪያት ወጥነት ባለው መልኩ እንዲቆዩ ማድረግ ይችላሉ, ይህም በፍሰት ሳይቲሜትሪ ትንተና ወቅት ትክክለኛ መለኪያዎች እና አስተማማኝ መረጃዎችን ይፈቅዳል.
ለትክክለኛ ፍሰት ሳይቶሜትሪ ትንተና ወሳኝ የሆኑትን የሴሉላር ፕሮቲኖችን እና ኑክሊክ አሲዶችን ትክክለኛነት ስለሚጠብቅ በትክክል ማስተካከል አስፈላጊ ነው. ሴሎች ካልተስተካከሉ, አወቃቀራቸው እና ሞለኪውላዊ ጠቋሚዎች ከጊዜ ወደ ጊዜ ሊበላሹ ወይም ሊለወጡ ይችላሉ, ይህም ወደማይታመን እና ትክክለኛ ያልሆነ ውጤት ያስከትላል. ማስተካከልም ህዋሶችን ለማረጋጋት ወሳኝ ሚና የሚጫወተው ለብዙ መለኪያ ትንተና ሲሆን ይህም የፍሰት ሳይቶሜትሪ ቁልፍ ጥንካሬዎች አንዱ ነው። ተመራማሪዎች እንደ የገጽታ ማርከሮች፣ ውስጠ-ሴሉላር ፕሮቲኖች እና የዲኤንኤ ይዘት ያሉ በርካታ የሕዋስ ገጽታዎችን በአንድ ጊዜ በአንድ ሙከራ እንዲገመግሙ ያስችላቸዋል። ተገቢው ጥገና ከሌለ የተገኘው መረጃ ወጥነት የሌለው ወይም ያልተሟላ ሊሆን ይችላል, ይህም የሙከራ ውጤቶችን በተሳሳተ መንገድ እንዲተረጎም ያደርጋል.
Paraformaldehyde (PFA) በፍሰት ሳይቶሜትሪ ውስጥ በሰፊው ጥቅም ላይ ከሚውሉት መጠገኛዎች አንዱ ነው፣ ይህም በዋነኝነት የሴል ሞርፎሎጂን እና አንቲጂኒሲቲን በመጠበቅ ረገድ ባለው ውጤታማነት ነው። በሴሎች ውስጥ ያሉ ፕሮቲኖችን በማገናኘት ይሰራል፣ ሁለቱም ሴሉላር መዋቅር እና የገጽታ ፕሮቲኖች ሳይበላሹ እንዲቆዩ ያደርጋል። ይህ PFA የሕዋስ ወለል ጠቋሚዎችን ለመጠበቅ በጣም ጥሩ ምርጫ ያደርገዋል፣በተለይ የገጽታ ፕሮቲን አገላለጽ በክትባት ሙከራዎች ውስጥ ሲተነተን።
ምክር፡-
● ማጎሪያ፡ 2-4% PFA በብዛት ጥቅም ላይ የሚውለው ለጥሩ መጠገኛ ነው።
● የመጠገጃ ጊዜ፡ ህዋሶች በፒኤፍኤ ውስጥ ለ15-30 ደቂቃዎች በ2-8°ሴ መከተብ አለባቸው።
● ማከማቻ፡- ከተጠገኑ በኋላ ህዋሶች በ2-8°ሴ ውስጥ ለአጭር ጊዜ ማከማቻ መቀመጥ አለባቸው። ቋሚ ሴሎችን ለረጅም ጊዜ ማከማቸት አስፈላጊ አይደለም, ምክንያቱም ይህ ወደ ጠቋሚ ትክክለኛነት ሊያመራ ይችላል.
ለ PFA ረዘም ላለ ጊዜ መጋለጥ ወደ ሴሉላር አውቶፍሎረሰንት ሊያመራ ስለሚችል እና በቀጣይ ማቅለሚያ እና ትንተና ላይ ጣልቃ ስለሚገባ ከመጠን በላይ ማስተካከልን ማስወገድ አስፈላጊ ነው. ለመጠገን ሁልጊዜ የሚፈለገውን አነስተኛ ጊዜ ይጠቀሙ።
የኢታኖል መጠገኛ በአብዛኛው ጥቅም ላይ የሚውለው የትንታኔ ትኩረት በዲ ኤን ኤ ይዘት ላይ ሲሆን ለምሳሌ በሴል ዑደት ጥናቶች ውስጥ ነው. ኤታኖል የሴል ሽፋን ውስጥ ዘልቆ በመግባት እና በሴሎች ውስጥ ያለውን ዲ ኤን ኤ በመጠበቅ የሚሠራ የእርጥበት ማስወገጃ ወኪል ነው። ይህ የኤታኖል መጠገኛን በተለይ በዲኤንኤ ላይ ለተመሰረቱ ምርመራዎች እና የሴል ዑደት ደረጃዎች ወይም የዲኤንኤ ይዘት እየተመረመሩ ባሉበት የሳይቶሜትሪ ፍሰቶች ላይ ጠቃሚ ያደርገዋል።
ምክር፡-
● ማጎሪያ፡ በተለምዶ ከ70-100% ኢታኖል ጥቅም ላይ ይውላል።
● የመጠገን ጊዜ፡- ለተሻለ ውጤት የኢታኖል መጠገኛ በተለምዶ ከ10-15 ደቂቃዎችን ይፈልጋል።
የኢታኖል ማስተካከያ የሕዋስ ዑደት ደረጃዎችን ለመጠበቅ ተስማሚ ነው, እና ለሴል ዑደት ትንተና እንደ ፕሮፒዲየም አዮዳይድ (PI) ካሉ ዲ ኤን ኤ-ማስያዣ ቀለሞች ጋር በማጣመር ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል.
ሜታኖል ሌላው በብዛት ጥቅም ላይ የሚውለው መጠገኛ ነው፣ በተለይም ለሴሉላር ውስጥ ትንታኔ። የሴል ሽፋን ውስጥ ዘልቆ በመግባት እና የሴሉን ውስጣዊ መዋቅሮች በማረጋጋት ይሠራል. ሜታኖል ሴሉላር ፕሮቲኖችን እና አንቲጂኖችን በመጠበቅ ረገድ ውጤታማ ቢሆንም፣ የሕዋስ መጨናነቅን ሊያስከትል ይችላል፣ ይህም እንደ የሕዋስ መጠን እና ሞርፎሎጂ ያሉ የአንዳንድ ባህሪያትን ትርጓሜ ሊጎዳ ይችላል።
ምክር፡-
● ትኩረት: በተለምዶ ከ90-100% ሜታኖል ጥቅም ላይ ይውላል.
● የመጠገን ጊዜ፡- ከ10-15 ደቂቃዎች ብዙ ጊዜ በቂ ነው።
ሜታኖል ማስተካከል ብዙውን ጊዜ የውስጠ-ህዋስ ፕሮቲኖችን ሲያጠና በተለይም በሳይቶፕላዝም ወይም ኒውክሊየስ ውስጥ ጠቋሚዎችን ሲመረምር ይሠራል። ይሁን እንጂ ተመራማሪዎች ሜታኖል ማስተካከልን በሚጠቀሙበት ጊዜ የሕዋስ ቅነሳን ግምት ውስጥ ማስገባት አለባቸው.
ፎርማሊን, በውሃ ውስጥ የፎርማለዳይድ መፍትሄ, ሌላው በፍሰት ሳይቶሜትሪ ውስጥ ጥቅም ላይ የሚውል ማስተካከያ ነው, ምንም እንኳን ከፒኤፍኤ ያነሰ የተለመደ ነው. ፎርማሊን በሂስቶሎጂ እና ኢሚውኖሂስቶኬሚስትሪ በሰፊው ጥቅም ላይ የዋለ ሲሆን ይህም የቲሹ ናሙናዎችን ለአጉሊ መነጽር ትንታኔ በሚገባ ይጠብቃል. ምንም እንኳን ፎርማሊን የሕዋስ አወቃቀሮችን ጠብቆ ማቆየት ቢችልም በሕዋስ መደርደር እና አንዳንድ የፍሎረሰንት አፕሊኬሽኖችን ስለሚያስተጓጉል ከቋሚ ቲሹ ናሙናዎች ጋር ካልሰራ በስተቀር በአጠቃላይ ፍሰት ሳይቶሜትሪ አይመከርም። ፎርማሊን ማስተካከል ለቲሹ ናሙናዎች በጣም ተስማሚ ነው, ለግለሰብ ሴሎች አይደለም.
ማስተካከያ |
ትኩረት መስጠት |
የመጠገን ጊዜ |
የሚመከር አጠቃቀም |
ፓራፎርማልዳይድ (PFA) |
2-4% |
15-30 ደቂቃዎች |
የሕዋስ ወለል ጠቋሚዎችን ለመጠበቅ ተስማሚ; ለበሽታ መከላከያ (immunophenotyping) የተለመደ |
ኢታኖል |
70-100% |
10-15 ደቂቃዎች |
ለዲኤንኤ ይዘት ትንተና እና የሕዋስ ዑደት ጥናቶች ምርጥ |
ሜታኖል |
90-100% |
10-15 ደቂቃዎች |
ለሴሉላር ፕሮቲን ትንተና ተስማሚ; የሕዋስ ቅነሳን ሊያስከትል ይችላል። |
ፎርማሊን |
10% (ፎርማልዴይድ) |
ይለያያል (እንደ ቲሹ ይወሰናል) |
በአጠቃላይ ለግል ህዋሶች ሳይሆን ለቋሚ ቲሹ ናሙናዎች ጥቅም ላይ ይውላል |
ከመስተካከሉ በፊት ሴሎችን ከቲሹ ወይም ከደም ናሙና መለየት አስፈላጊ ነው. ሴንትሪፉግሽን በእገዳ ውስጥ ህዋሶችን ለማሰባሰብ የሚያገለግል በጣም የተለመደ ዘዴ ነው። እንዲሁም ማንኛውንም የባህል ሚዲያ ወይም ቀሪ ብክለትን ለማስወገድ ሴሎቹን በደንብ ማጠብ አስፈላጊ ነው ፣ ይህም የማስተካከል ሂደቱን ሊያደናቅፍ ይችላል።
1. የሕዋስ ማግለል፡ የፍላጎት ሴሎችን ለመለየት እንደ ሴንትሪፍጌሽን ወይም ሴል መለየት ያሉ መደበኛ የማግለል ዘዴዎችን ይጠቀሙ።
2. ማጠብ፡ ሴሎቹን በፎስፌት ባፈርድ ሳላይን (PBS) በማጠብ የማስተካከል ሂደት ላይ ተጽእኖ ሊያሳድሩ የሚችሉ ቀሪ ሚዲያዎችን እና ተላላፊዎችን ለማስወገድ።
ሴሎቹ ከተዘጋጁ በኋላ, ቀጣዩ ደረጃ ማስተካከያውን ወደ ሴል እገዳ መጨመር ነው. ለወራጅ ሳይቶሜትሪ በብዛት ጥቅም ላይ የሚውለው መጠገኛ ከ2-4% ፒኤፍኤ መፍትሄ ነው።
1. ማስተካከያውን በሴል እገዳ ላይ ይጨምሩ, በደንብ የተደባለቀ መሆኑን ያረጋግጡ.
2. በ 2-8 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ ለ 15-30 ደቂቃዎች ህዋሶችን በመጠገን ያሞቁ.
3. ከክትባቱ በኋላ, ከመጠን በላይ ጥገናን ለማስወገድ ሴሎቹን ሁለት ጊዜ በፒቢኤስ ያጠቡ.
ከተስተካከለ በኋላ ሴሎቹ በጥንቃቄ መያዝ አለባቸው. ተጨማሪ ትንታኔ ካስፈለገ ሴሎች ከመተንተን በፊት መበከል አለባቸው. ህዋሶችን ለወደፊት ትንተና ለማከማቸት ካቀዱ, በተገቢው ቋት ውስጥ እንደገና ያግዷቸው እና በ2-8 ° ሴ ያከማቹ. ከመጠን በላይ መጠገን ወደ autofluorescence መጨመር እና የሲግናል ጥራት እንዲቀንስ ስለሚያደርግ ህዋሶችን በመጠገን ውስጥ ለረጅም ጊዜ ከመተው ይቆጠቡ።
ከመጠን በላይ ማስተካከል የሚከሰተው ሴሎች ለረጅም ጊዜ ለመጠገን ሲጋለጡ ነው, ይህም የሴሉላር ፕሮቲኖችን ከመጠን በላይ ማገናኘት እና የመረጃውን ጥራት ሊጎዳ ይችላል. ይህ ወደ autofluorescence፣ ፀረ እንግዳ አካላት ትስስር እንዲቀንስ እና ትክክለኛ ያልሆነ የፍሰት ሳይቶሜትሪ መለኪያዎችን ያስከትላል።ለእርስዎ የተለየ የሕዋስ አይነት ሁል ጊዜ የሚመከሩትን የማረፊያ ጊዜዎች ያረጋግጡ እና ከመጠን በላይ መጠገንን ለማስወገድ ይሞክሩ።
በጣም ጥሩው የመጠገጃ ጊዜ እንደ የሕዋስ ዓይነት እና እንደ የሙከራው ተፈጥሮ ሊለያይ ይችላል። ለምሳሌ የበሽታ ተከላካይ ሕዋሳት ከቲሹ ናሙናዎች አጠር ያሉ የመጠገን ጊዜ ሊፈልጉ ይችላሉ። በናሙና ዓይነት ልዩ ፍላጎቶች ላይ በመመስረት የመጠገጃ ጊዜውን ያስተካክሉ። ለገጽታ ፕሮቲን ትንተና, አጭር የማረጋገጫ ጊዜ (10-15 ደቂቃዎች) አብዛኛውን ጊዜ በቂ ነው. ለሴሉላር ቀለም ወይም ለዲኤንኤ ትንተና ረዘም ያለ የመጠገን ጊዜ ሊያስፈልግ ይችላል።
ሴሎቹን ካስተካከሉ በኋላ በፀረ እንግዳ አካላት ወይም በፍሎረሰንት ማቅለሚያዎች መቀባት በፍሰት ሳይቶሜትሪ ትንተና ውስጥ ወሳኝ እርምጃ ነው። አንዳንድ የፍሎረሰንት ማቅለሚያዎች፣በተለይ የታንዳም ማቅለሚያዎች ለመጠገን ስሜታዊ ሊሆኑ ይችላሉ እና ሴሎቹ ከመጠን በላይ ከተስተካከሉ ሊበላሹ ይችላሉ።ለተመቻቸ የማቅለም ውጤት በተቻለ መጠን ሴሎቹን ከመስተካከሉ በፊት መቀባት ይመከራል። ይህ የቀለም መበስበስን ለመከላከል እና ጠንካራ የፍሎረሰንት ምልክቶችን ለማረጋገጥ ይረዳል።
ለአጭር ጊዜ ማከማቻ ቋሚ ሴሎች በማቀዝቀዣ ውስጥ ከ2-8 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ሊቀመጡ ይችላሉ. ከተስተካከለ በኋላ በአንድ ወይም በሁለት ቀናት ውስጥ ሴሎችን ለመተንተን ሲያቅዱ ይህ ተስማሚ ነው. የፍሎረሰንት ምልክቶችን ሊጎዳ የሚችለውን የፎቶ ማንቆርቆር ለመከላከል ሁል ጊዜ ቋሚ ሴሎችን በጨለማ ውስጥ ያከማቹ።
ለረጅም ጊዜ ማከማቻ፣ ህዋሶች በክሪዮፕርሴፕሽን ሚዲያ ውስጥ ሊቀዘቅዙ ይችላሉ። አንድ የተለመደ ክሪዮፕሴፕሽን መካከለኛ 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) እና 90% fetal bovine serum (FBS) ያካትታል። ነገር ግን፣ እንደ mFreSR™ ወይም CryoStor™ CS10 ያሉ ከሴረም-ነጻ ክሪዮፕረሰርዜሽን መፍትሄዎችም ይገኛሉ እና ከFBS ጋር ተያይዘው የሚመጡ ችግሮችን ለማስወገድ ጥቅም ላይ ሊውሉ ይችላሉ። የበረዶ ክሪስታል መፈጠርን ለመከላከል፣ ሴሎችን ለማቀዝቀዝ ቁጥጥር የሚደረግበት ማቀዝቀዣ ይጠቀሙ። ይህ የሕዋስ አዋጭነትን ለመጠበቅ ይረዳል እና ትክክለኛውን ማከማቻ ያረጋግጣል።
ተገቢ ያልሆነ ጥገና ወደ ብዙ ችግሮች ሊመራ ይችላል, ይህም autofluorescenceን, ፀረ እንግዳ አካላትን ማገናኘት ይቀንሳል እና ደካማ የሕዋስ አዋጭነት. እነዚህ ጉዳዮች የፍሰት ሳይቶሜትሪ ውጤቶችን ትክክለኛነት እና አስተማማኝነት በእጅጉ ሊነኩ ይችላሉ። ሁልጊዜ ለእርስዎ የተለየ የናሙና ዓይነት የመጠግን ፕሮቶኮሎችን ያረጋግጡ፣ እና የመጠገን ሁኔታው ለሚተነተነው የሕዋስ ዓይነት እና ማርከሮች ተስማሚ መሆናቸውን ያረጋግጡ።
ለእርስዎ ፍሰት ሳይቶሜትሪ ሙከራ ተገቢውን ማስተካከያ መምረጥ አስተማማኝ እና ትክክለኛ ውጤቶችን ለማግኘት ወሳኝ ነው። የተለያዩ ማስተካከያዎች ለተለያዩ አፕሊኬሽኖች የተሻሉ ናቸው. ለምሳሌ፣ ፒኤፍኤ በተለምዶ ላዩን ፕሮቲን ለመተንተን ጥቅም ላይ ይውላል፣ ኤታኖል ደግሞ በዲኤንኤ ላይ ለተመሰረቱ ጥናቶች ተመራጭ ነው። ሙከራውን ከመጀመርዎ በፊት ለእርስዎ የተለየ መተግበሪያ ምርጡን መጠገኛ ይመርምሩ እና የማስተካከያ ፕሮቶኮሉን በዚሁ መሠረት ያስተካክሉ።
የተሳካ የፍሰት ሳይቶሜትሪ ትንታኔን ለማግኘት ትክክለኛ የሕዋስ ማስተካከል አስፈላጊ ነው። ሴሉላር አወቃቀሮችን ለመጠበቅ ይረዳል እና የፕሮቲን እና የዲኤንኤ ትክክለኛነት ያረጋግጣል. ትክክለኛ የመጠገን ፕሮቶኮሎችን በመከተል እና ከመጠን በላይ መጠገንን በማስቀረት ተመራማሪዎች የመረጃ ትክክለኛነትን እና አስተማማኝነትን ማሳደግ ይችላሉ። ለሙከራዎ ተገቢውን ማስተካከያ መምረጥ የውጤቶችዎን አጠቃላይ ጥራት ያሻሽላል። እነዚህን ምርጥ ተሞክሮዎች መተግበር የፍሰት ሳይቶሜትሪ ትንተና በሴሉላር ተግባራት ላይ ተከታታይ እና ሊባዙ የሚችሉ ግንዛቤዎችን እንደሚያቀርብ ያረጋግጣል።
ትክክለኛው የሕዋስ ማስተካከል በፍሰት ሳይቶሜትሪ ውስጥ ቁልፍ ሚና ይጫወታል, እና ምርቶች ከ HKeybio አስተማማኝ መፍትሄዎችን ያቀርባል. የእነርሱ አቅርቦቶች ከፍተኛ ጥራት ያላቸውን ውጤቶች ያረጋግጣሉ እና በዓለም ዙሪያ ባሉ ተመራማሪዎች ለትክክለኛ ህዋስ ትንተና የታመኑ ናቸው.
መ፡ የሕዋስ ማስተካከል ሴሉላር አወቃቀሮችን ስለሚጠብቅ እና ለትክክለኛ ትንተና የፕሮቲን እና የዲኤንኤ ታማኝነት ስለሚያረጋግጥ በወራጅ ሳይቶሜትሪ ውስጥ ወሳኝ ነው።
መ: ሴሉላር ታማኝነትን ለመጠበቅ ህዋሶች በተለምዶ ለ15-30 ደቂቃዎች ከ2-4% paraformaldehyde (PFA) መፍትሄ መጠገን አለባቸው።
መ፡ አዎ፣ የኤታኖል መጠገኛ በተለምዶ ለዲኤንኤ ይዘት በፍሰት ሳይቶሜትሪ በተለይም ለሴል ዑደት ጥናቶች ጥቅም ላይ ይውላል።
መ: ከመጠን በላይ መጠገን ከመጠን በላይ መሻገርን ሊያስከትል ይችላል፣ ወደ autofluorescence እና ደካማ ፀረ-ሰው ማሰርን ያስከትላል፣ ይህም የፍሰት ሳይቶሜትሪ ውጤቶችን ሊጎዳ ይችላል።
