Introduction
Vous êtes-vous déjà demandé comment la cytométrie en flux permet-elle une analyse cellulaire aussi précise et fiable ? La clé de résultats précis réside dans une bonne fixation des cellules. La cytométrie en flux permet aux chercheurs d'étudier diverses caractéristiques cellulaires, de la taille à l'intensité de la fluorescence. Cependant, sans une fixation appropriée, les données peuvent ne pas refléter les véritables propriétés cellulaires. Dans cet article, nous explorerons l’importance de la fixation cellulaire en cytométrie en flux, discuterons des différentes méthodes de fixation et partagerons des conseils pour des résultats optimaux.
Qu’est-ce que la fixation cellulaire en cytométrie en flux ?
Définition de la fixation cellulaire
La fixation cellulaire est un processus qui stabilise et préserve les cellules en empêchant les modifications de leur structure, de leur fonction et de leur composition moléculaire. Ce processus est réalisé en réticulant chimiquement des protéines, des lipides et d'autres composants cellulaires, « gelant » efficacement les cellules dans leur état actuel. Ceci est particulièrement important en cytométrie en flux car cela évite la dégradation des marqueurs cellulaires ou l’altération des structures cellulaires lors de l’analyse. En fixant les cellules, les chercheurs peuvent garantir que leurs caractéristiques restent cohérentes, ce qui permet d'obtenir des mesures précises et des données fiables lors de l'analyse par cytométrie en flux.
Pourquoi la fixation est importante
Une bonne fixation est essentielle car elle maintient l’intégrité des protéines cellulaires et des acides nucléiques, qui sont cruciaux pour une analyse précise par cytométrie en flux. Si les cellules ne sont pas fixées, leur structure et leurs marqueurs moléculaires peuvent se dégrader ou changer avec le temps, conduisant à des résultats peu fiables et inexacts. La fixation joue également un rôle essentiel dans la stabilisation des cellules pour l’analyse multiparamétrique, ce qui constitue l’un des principaux atouts de la cytométrie en flux. Il permet aux chercheurs d’évaluer simultanément plusieurs caractéristiques cellulaires, telles que les marqueurs de surface, les protéines intracellulaires et le contenu en ADN, au cours d’une seule expérience. Sans une fixation appropriée, les données obtenues pourraient être incohérentes ou incomplètes, conduisant à une mauvaise interprétation des résultats expérimentaux.
Types de méthodes de fixation pour la cytométrie en flux
Fixation du paraformaldéhyde (PFA)
Le paraformaldéhyde (PFA) est l’un des fixateurs les plus utilisés en cytométrie en flux, principalement en raison de son efficacité à préserver la morphologie et l’antigénicité cellulaire. Il agit en réticulant les protéines au sein des cellules, garantissant ainsi que la structure cellulaire et les protéines de surface restent intactes. Cela fait du PFA un excellent choix pour préserver les marqueurs de surface cellulaire, en particulier lors de l’analyse de l’expression des protéines de surface dans des expériences d’immunophénotypage.
Recommandation:
● Concentration : 2 à 4 % de PFA est couramment utilisé pour une fixation optimale.
● Temps de fixation : les cellules doivent être incubées dans du PFA pendant 15 à 30 minutes à 2-8°C.
● Stockage : Après fixation, les cellules doivent être conservées entre 2 et 8°C pour un stockage à court terme. Il est important de ne pas stocker les cellules fixées pendant des périodes prolongées, car cela pourrait entraîner une perte de l’intégrité du marqueur.
Il est important d’éviter une fixation excessive, car une exposition prolongée au PFA peut conduire à une autofluorescence cellulaire et interférer avec la coloration et l’analyse ultérieures. Utilisez toujours le temps minimal requis pour la fixation.
Fixation de l'éthanol
La fixation de l'éthanol est couramment utilisée lorsque l'analyse se concentre sur la teneur en ADN, comme dans les études du cycle cellulaire. L'éthanol est un agent déshydratant qui agit en pénétrant dans la membrane cellulaire et en préservant l'ADN des cellules. Cela rend la fixation de l'éthanol particulièrement utile pour les analyses basées sur l'ADN et les analyses de cytométrie en flux où les étapes du cycle cellulaire ou le contenu de l'ADN sont examinés.
Recommandation:
● Concentration : Généralement, 70 à 100 % d'éthanol est utilisé.
● Temps de fixation : La fixation de l'éthanol nécessite généralement 10 à 15 minutes pour des résultats optimaux.
La fixation de l'éthanol est idéale pour préserver les phases du cycle cellulaire et peut être utilisée en combinaison avec des colorants liant l'ADN tels que l'iodure de propidium (PI) pour l'analyse du cycle cellulaire.
Fixation du méthanol
Le méthanol est un autre fixateur couramment utilisé, notamment pour les analyses intracellulaires. Il agit en pénétrant dans la membrane cellulaire et en stabilisant les structures internes de la cellule. Bien que le méthanol soit efficace pour préserver les protéines cellulaires et les antigènes, il peut provoquer un rétrécissement des cellules, ce qui pourrait avoir un impact sur l'interprétation de certaines caractéristiques, telles que la taille et la morphologie des cellules.
Recommandation:
● Concentration : Généralement, 90 à 100 % de méthanol est utilisé.
● Temps de fixation : 10 à 15 minutes suffisent généralement.
La fixation du méthanol est souvent utilisée lors de l'étude des protéines intracellulaires, en particulier lors de l'examen de marqueurs à l'intérieur du cytoplasme ou du noyau. Cependant, les chercheurs doivent tenir compte du potentiel de rétrécissement des cellules lors de l’utilisation de la fixation au méthanol.
Autres fixateurs (par exemple, formol)
Le formol, une solution de formaldéhyde dans l'eau, est un autre fixateur utilisé en cytométrie en flux, bien qu'il soit moins courant que le PFA. Le formol est largement utilisé en histologie et en immunohistochimie, où il préserve efficacement les échantillons de tissus pour les analyses microscopiques. Bien que le formol puisse préserver les structures cellulaires, il n’est généralement pas recommandé pour la cytométrie en flux, sauf si l’on travaille avec des échantillons de tissus fixes, car il peut interférer avec le tri cellulaire et certaines applications de fluorescence. La fixation au formol est mieux adaptée aux échantillons de tissus qu’aux cellules individuelles.
Fixateur |
Concentration |
Temps de fixation |
Utilisation recommandée |
Paraformaldéhyde (PFA) |
2-4% |
15-30 minutes |
Idéal pour préserver les marqueurs de surface cellulaire ; commun pour l’immunophénotypage |
Éthanol |
70-100% |
10-15 minutes |
Idéal pour l'analyse du contenu de l'ADN et les études du cycle cellulaire |
Méthanol |
90-100% |
10-15 minutes |
Convient à l'analyse des protéines intracellulaires ; peut provoquer un rétrécissement des cellules |
Formol |
10% (formaldéhyde) |
Varie (dépend du tissu) |
Généralement utilisé pour les échantillons de tissus fixes, pas pour les cellules individuelles |
Guide étape par étape pour réparer les cellules pour la cytométrie en flux
Préparation de l'échantillon de cellules
Avant la fixation, il est essentiel d’isoler les cellules de l’échantillon de tissu ou de sang. La centrifugation est la méthode la plus couramment utilisée pour concentrer les cellules dans une suspension. Il est également essentiel de laver soigneusement les cellules pour éliminer tout milieu de culture ou tout contaminant résiduel susceptible d’interférer avec le processus de fixation.
1. Isolement cellulaire : utilisez des méthodes d’isolement standard telles que la centrifugation ou le tri cellulaire pour séparer les cellules d’intérêt.
2. Lavage : Laver les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer les médias résiduels et les contaminants qui pourraient affecter le processus de fixation.
Procédure de fixation
Une fois les cellules préparées, l’étape suivante consiste à ajouter le fixateur à la suspension cellulaire. Le fixateur le plus couramment utilisé pour la cytométrie en flux est une solution de PFA à 2-4 %.
1. Ajoutez le fixateur à la suspension cellulaire en vous assurant qu'elle est bien mélangée.
2. Incuber les cellules avec le fixateur pendant 15 à 30 minutes à 2-8°C.
3. Après l'incubation, laver les cellules deux fois avec du PBS pour éliminer l'excès de fixateur.
Étapes post-fixation
Après fixation, les cellules doivent être manipulées avec précaution. Si une analyse plus approfondie est nécessaire, les cellules doivent être colorées avant l’analyse. Si vous envisagez de stocker les cellules pour une analyse ultérieure, remettez-les en suspension dans un tampon approprié et conservez-les à 2-8°C. Évitez de laisser les cellules dans le fixateur pendant de longues périodes, car une fixation excessive peut entraîner une autofluorescence accrue et une qualité de signal réduite.
Conseils pour une fixation optimale en cytométrie en flux
Éviter la surfixation
La surfixation se produit lorsque les cellules sont exposées au fixateur pendant trop longtemps, ce qui peut entraîner une réticulation excessive des protéines cellulaires et compromettre la qualité des données. Cela peut entraîner une autofluorescence, une réduction de la liaison des anticorps et des mesures de cytométrie en flux inexactes. Vérifiez toujours les temps de fixation recommandés pour votre type de cellule spécifique et expérimentez pour éviter une fixation excessive.
Temps de fixation par rapport au type d'échantillon
Le temps de fixation optimal peut varier en fonction du type de cellule et de la nature de l'expérience. Par exemple, les cellules immunitaires peuvent nécessiter des temps de fixation plus courts que les échantillons de tissus. Ajustez le temps de fixation en fonction des besoins spécifiques du type d’échantillon. Pour l’analyse des protéines de surface, un temps de fixation plus court (10 à 15 minutes) est généralement suffisant. Pour la coloration intracellulaire ou l’analyse de l’ADN, un temps de fixation plus long peut être nécessaire.
Coloration après fixation
Après avoir fixé les cellules, la coloration avec des anticorps ou des colorants fluorescents est une étape critique de l’analyse par cytométrie en flux. Certains colorants fluorescents, en particulier les colorants tandem, peuvent être sensibles à la fixation et se dégrader si les cellules sont trop fixées. Pour des résultats de coloration optimaux, il est recommandé de colorer les cellules avant la fixation dans la mesure du possible. Cela peut aider à prévenir la dégradation des colorants et à garantir des signaux de fluorescence plus forts.
Stockage de cellules fixes pour la cytométrie en flux
Stockage à court terme
Pour une conservation à court terme, les cellules fixes peuvent être conservées au réfrigérateur entre 2 et 8°C. C’est idéal lorsque vous prévoyez d’analyser les cellules dans un délai d’un jour ou deux après la fixation. Conservez toujours les cellules fixées dans l’obscurité pour éviter le photoblanchiment, qui peut affecter les signaux fluorescents.
Stockage à long terme
Pour un stockage à long terme, les cellules peuvent être congelées dans un milieu de cryoconservation. Un milieu de cryoconservation typique se compose de 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) et de 90 % de sérum bovin fœtal (FBS). Cependant, des solutions de cryoconservation sans sérum comme mFreSR™ ou CryoStor™ CS10 sont également disponibles et peuvent être utilisées pour éviter les problèmes associés au FBS. Pour éviter la formation de cristaux de glace, utilisez un congélateur à vitesse contrôlée pour congeler les cellules. Cela aide à maintenir la viabilité cellulaire et garantit un stockage approprié.
Pièges courants à éviter lors de la fixation cellulaire pour la cytométrie en flux
Effets d'une mauvaise fixation
Une mauvaise fixation peut entraîner plusieurs problèmes, notamment l’autofluorescence, une liaison réduite des anticorps et une mauvaise viabilité cellulaire. Ces problèmes peuvent affecter considérablement la précision et la fiabilité des résultats de cytométrie en flux. Vérifiez toujours les protocoles de fixation pour votre type d’échantillon spécifique et assurez-vous que les conditions de fixation sont appropriées pour le type de cellule et les marqueurs analysés.
Choisir le bon fixateur pour votre application
Le choix du fixateur approprié pour votre expérience de cytométrie en flux est crucial pour obtenir des résultats fiables et précis. Différents fixateurs conviennent mieux à différentes applications. Par exemple, le PFA est couramment utilisé pour l'analyse des protéines de surface, tandis que l'éthanol est idéal pour les études basées sur l'ADN. Avant de commencer l'expérience, recherchez le meilleur fixateur pour votre application spécifique et ajustez le protocole de fixation en conséquence.
Conclusion
Une bonne fixation cellulaire est essentielle pour réussir l’analyse par cytométrie en flux. Il contribue à préserver les structures cellulaires et assure l’intégrité des protéines et de l’ADN. En suivant des protocoles de fixation appropriés et en évitant une fixation excessive, les chercheurs peuvent améliorer l'exactitude et la fiabilité des données. La sélection du fixateur approprié pour votre expérience améliore la qualité globale de vos résultats. La mise en œuvre de ces bonnes pratiques garantit que votre analyse par cytométrie en flux fournit des informations cohérentes et reproductibles sur les fonctions cellulaires.
Une bonne fixation cellulaire joue un rôle clé dans la cytométrie en flux, et les produits issus de HKeybio propose des solutions fiables. Leurs offres garantissent des résultats de haute qualité et sont approuvées par les chercheurs du monde entier pour une analyse cellulaire précise.
FAQ
Q : Quelle est l’importance de la fixation cellulaire en cytométrie en flux ?
R : La fixation cellulaire est cruciale en cytométrie en flux car elle préserve les structures cellulaires et garantit l’intégrité des protéines et de l’ADN pour une analyse précise.
Q : Combien de temps les cellules doivent-elles être fixées pour la cytométrie en flux ?
R : Les cellules doivent généralement être fixées pendant 15 à 30 minutes avec une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 2 à 4 % pour maintenir l’intégrité cellulaire.
Q : Puis-je utiliser de l’éthanol pour la fixation cellulaire en cytométrie en flux ?
R : Oui, la fixation de l’éthanol est couramment utilisée pour l’analyse du contenu en ADN en cytométrie en flux, en particulier pour les études du cycle cellulaire.
Q : Que se passe-t-il si les cellules sont trop fixées en cytométrie en flux ?
R : Une fixation excessive peut provoquer une réticulation excessive, conduisant à une autofluorescence et à une mauvaise liaison des anticorps, ce qui peut affecter les résultats de cytométrie en flux.
