Оршил
Эрдэмтэд хэдэн секундын дотор хэдэн мянган эсийг шинжилдэг талаар та бодож байсан уу? Урсгалын цитометр нь үүнийг боломжтой болгодог хүчирхэг хэрэгсэл юм. Энэ нь судлаачдад бие даасан эсийн физик, химийн шинж чанарыг хурдан бөгөөд үнэн зөв судлах боломжийг олгодог.
Энэ нийтлэлд бид урсгалын цитометрийн үр дүнг хэрхэн уншиж, тайлбарлах талаар судлах болно. Та чухал тэмдэглэгээг хэрхэн тодорхойлох, өвчний нөхцөл байдлыг үнэлэх, эсийн үйл ажиллагааны талаархи ойлголттой болох талаар суралцах болно. Эдгээр үр дүнг ойлгох нь шинжлэх ухааны судалгаа, эмнэлзүйн практикт үндэслэлтэй шийдвэр гаргахад зайлшгүй шаардлагатай.
Урсгалын цитометрийн үр дүнгийн талаархи ойлголт
Урсгалын цитометрийн үндэс
Урсгалын цитометр нь эс тус бүрээр тархсан гэрлийг хэмжихийн зэрэгцээ лазер туяагаар эсийг дамжуулж ажилладаг. Тарсан гэрэл нь судлаачдад эсийн хэмжээ, дотоод нарийн төвөгтэй байдлын талаар чухал мэдээлэл өгдөг. Нэмж дурдахад флюресцент маркерууд нь эсийн доторх эсвэл доторх тодорхой уурагуудыг шошголоход ашиглагддаг бөгөөд эсийн шинж чанарын талаархи нэмэлт ойлголтыг өгдөг.
Урсгалын цитометр нь гэрлийн тархалт ба флюресценцийн параметрүүдийн мэдээллийг цуглуулдаг. Эсүүд лазертай харьцах үед гэрлийн тархалтын өгөгдөл үүсдэг бөгөөд энэ нь тэдгээрийн хэмжээ, дотоод бүтцийн талаархи мэдээллийг өгдөг. Энэ өгөгдөл нь эсийн ширхэглэл, хэлбэрийг тодорхойлоход тусалдаг. Тодорхой флюресцент хаягууд нь өдөөх үед гэрэл ялгаруулдаг уураг эсвэл ДНХ зэрэг эсийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдтэй холбогдох үед флюресценцийн мэдээллийг цуглуулдаг. Эдгээр дохио нь эсийн зан төлөвийг ойлгоход чухал ач холбогдолтой гадаргуугийн уураг эсвэл ДНХ-ийн агууламж зэрэг тодорхой эсийн маркеруудыг тодорхойлоход тусалдаг.
Урсгалын цитометр дэх өгөгдлийн төрлүүд
● Forward scatter (FSC): Нүдний хэмжээг хэмждэг. Том эсүүд нь илүү их гэрэл хазайдаг тул урагшаа илүү их тархалт үүсгэдэг.
● Side scatter (SSC): Эсийн нарийн төвөгтэй байдал эсвэл дотоод бүтцийг заана. Энэ параметр нь эсийн нарийн ширхэгтэй байдал, нарийн төвөгтэй байдлын талаархи ойлголтыг өгдөг бөгөөд энэ нь эсийн төрлийг ялгах эсвэл хэвийн бус байдлыг илрүүлэхэд тустай.
● Флюресценцийн параметрүүд: Эдгээр нь тэмдэглэгдсэн эсрэгбие, будагч бодис эсвэл уургаас ялгарах тусгай флюресценцийн эрчмийг хэмждэг. Олон тооны тэмдэглэгээний флюресценцийг хэмжих замаар урсгалын цитометр нь туршилтын зорилгоос хамааран тодорхой рецептор, ДНХ эсвэл уураг зэрэг эсийн тодорхой бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг тодорхойлж чадна.
Параметр |
Тодорхойлолт |
Хэрэглээ |
Forward Scatter (FSC) |
Эсийн хэмжээг хэмждэг. Том эсүүд илүү их гэрэл цацдаг. |
Эсийн харьцангуй хэмжээг тодорхойлдог. |
Хажуугийн тархалт (SSC) |
Эсийн дотоод нарийн төвөгтэй байдал эсвэл нарийн ширхэгтэй байдлыг хэмждэг. |
Эсийн нарийн төвөгтэй байдал эсвэл бүтцийг үнэлэхэд тусалдаг. |
Флюресцент |
Шошготой тэмдэглэгээнээс ялгарсан гэрлийг хэмждэг. |
Уураг эсвэл ДНХ зэрэг эсийн тодорхой бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг тодорхойлдог. |
Урсгалын цитометрийн үндсэн график дүрслэлүүд
Гистограм
Гистограм нь урсгалын цитометрийн дан параметр өгөгдлийг дүрслэн харуулах шулуун арга юм. Тэд ихэвчлэн y-тэнхлэгийн гэрлийг эсвэл флюресцентийн эрч хүчийг харуулдаг, x-тэнхлэгийн эрчмийг x тэнхлэгийн тоог илэрхийлнэ. Энэхүү энг��йн график дүрслэл нь эсийн хүн амын тоогоор дамжуулан ганц параметрийн тархалтыг хялбархан ойлгоход тусалдаг.
Гистограммд та дараахь зүйлийг ажиглаж болно.
● Оргил дахь шилжилт: Флюресценцийн эрчим баруун тийш шилжих нь зорилтот тэмдэглэгээний илэрхийлэл нэмэгдэж байгааг илэрхийлдэг. Энэ нь эмчилгээнд хариу үйлдэл үзүүлэх гэх мэт уургийн илэрхийлэл өөрчлөгдөхөд тустай үзүүлэлт юм.
● Оргил тархалт: Оргилын тархалт нь эсийн популяци даяар маркерын илэрхийлэлийн хувьсах байдлын талаарх ойлголтыг өгдөг. Илүү өргөн оргил нь янз бүрийн илэрхийлэлийн түвшинтэй илүү олон янзын популяцийг илтгэж болох бол нарийн оргил нь жигд байгааг харуулж байна.
Цэгэн график ба тараагч график
Хоёр параметрийн өгөгдлийг харуулахын тулд цэгийн графикийг ихэвчлэн ашигладаг. Эдгээр графикууд нь урагш тараах (FSC) ба хажуугийн тархалт (SSC) гэх мэт хоёр ялгаатай параметрийн хоорондын хамаарлыг ажиглах боломжийг олгодог. Цэгийн графикийг ашигласнаар та нэг дүрслэлд олон параметрийн хамаарлыг шинжлэх боломжтой.
● Gating: Цэгийн график дээр та цаашдын шинжилгээнд зориулж тодорхой дэд бүлгүүдийг тусгаарлахын тулд хаалгануудыг (тэгш өнцөгт, тойрог эсвэл олон өнцөгт) ашиглаж болно. Gating нь хэмжээ, ширхэглэл, тэмдэглэгээний илэрхийлэл зэрэг тодорхой шалгуурыг хангасан популяцид анхаарлаа төвлөрүүлэх боломжийг олгодог.
● Олон параметрийн шинжилгээ: Цэгийн график нь хоёр ба түүнээс дээш хувьсагчийн хоорондын хамаарлыг дүрслэн харуулахад тусалж, маркер эсвэл тархалтын шинж чанар гэх мэт олон шалгуурт тулгуурлан өөр өөр эсийн популяцийг ялгах боломжийг олгоно. Энэ нь нарийн төвөгтэй эсвэл нэг төрлийн эсийн популяцитай харьцах үед ялангуяа ашигтай байдаг.
Эсийн популяцийг тодорхойлох хаалганы стратеги
Хаалганы техник |
Тодорхойлолт |
Хэрэглээний хэрэг |
Quadrant Gating |
Хуйвалдааныг дөрвөн квадрат руу хуваана. |
Хоёр параметрийг шинжлэхэд хэрэгтэй (жишээ нь, FSC vs SSC). |
Полигон хаалга |
Илүү олон төрлийн өгөгдлийн цэгүүдийг оруулахын тулд тусгай хэлбэрийг бий болгодог. |
Илүү нарийн төвөгтэй эсвэл жигд бус хэлбэртэй популяцид тохиромжтой. |
Эллипс хаалга |
Квадранттай төстэй боловч эллипс бүсийг үүсгэдэг. |
Төвлөрсөн бус хүн амын хувьд үр дүнтэй. |
Gating-ийн танилцуулга
Gating нь урсгалын цитометрийн чухал арга бөгөөд тодорхой эсийн популяцийг илүү том дээжээс ялгаж салгах боломжийг олгодог. Урсгалын цитометрийн өгөгдөлдөө хаалгыг ашигласнаар та хэмжээ, нарийн төвөгтэй байдал эсвэл тэмдэглэгээний илэрхийлэл зэрэг тодорхой шинж чанаруудыг харуулсан эсүүдэд анхаарлаа төвлөрүүлж болно.
Хаалганы үйл явц нь ихэвчлэн дараахь зүйлийг агуулдаг.
● Хүн амыг сонгох: Гейтс нь мэдэгдэж байгаа шинж чанарууд дээр суурилсан эсийн тодорхой дэд хэсгүүдийг тусгаарлахад тусалдаг. Жишээлбэл, та тодорхой тэмдэглэгээ (жишээ нь T-ийн хувьд CD, CD3 T эсийг) эсвэл тодорхой тархины шинж чанар бүхий эсүүд дээр суулгаж болно.
● Хүсээгүй популяцийг оруулахгүй: Гейтс нь таны анализыг гажуудуулж болох үхсэн эс, хог хаягдал гэх мэт хүсээгүй тоосонцорыг арилгахад тусалдаг. Энэ нь таны дүн шинжилгээ хийсэн өгөгдөл үнэн зөв, судалгаанд тань хамааралтай болохыг баталгаажуулдаг.
Популяцийг шүүхдээ Gating-ийг хэрхэн ашиглах вэ
Урсгалын цитометрийн өгөгдлийг үр дүнтэй тайлбарлахын тулд сонирхсон популяцид чиглэсэн зохих хаалгыг тохируулах нь чухал юм. Жишээ нь:
● Үхсэн эсийг эс тооцвол: Үхсэн эсүүд нь ихэвчлэн өвөрмөц тархалттай шинж чанартай байдаг тул тэдгээрийг амьдрах чадвартай эсээс ялгахад ашиглаж болно. Урд тархалт (FSC) ба хажуугийн тархалт (SSC) дээр хаалт хийснээр таны өгөгдлийг гажуудуулж болзошгүй үхсэн эсвэл апоптозын эсүүдийг хасах боломжтой.
● Тодорхой популяцуудыг тусгаарлах: Gating нь маркер эсвэл физик шинж чанарт тулгуурлан тодорхой эсийн дэд бүлгийг сонгож, дүн шинжилгээ хийх боломжийг олгодог. Жишээлбэл, та тодорхой гадаргуугийн уураг (жишээ нь, CD3) руу чиглүүлснээр Т эсүүд рүү нэвтэрч, дараа нь тэдгээрийн өөр маркерын (жишээлбэл, цитокины түвшин) илэрхийлэлд дүн шинжилгээ хийж болно.
Нарийвчилсан урсгалын цитометрийн шинжилгээ
Олон өнгийн урсгалын цитометр
Олон өнгийн урсгалын цитометр нь нэг дээжинд янз бүрийн эсийн тэмдэглэгээг нэгэн зэрэг шинжлэхийн тулд олон флюресцент маркеруудыг ашигладаг дэвшилтэт техник юм. Энэ арга нь эсийн цогц холимог дотор эсийн төрөл ба дэд төрлүүдийг ялгах чадварыг ихээхэн сайжруулдаг.
● Давуу тал: Олон өнгийн урсгалын цитометрийн гол давуу тал нь олон параметрийг нэгэн зэрэг шинжлэх боломжийг олгож, туршилтыг илүү үр дүнтэй болгодог. Энэ нь нэг эсийн популяци дээр хэд хэдэн тэмдэглэгээг шалгах шаардлагатай үед ялангуяа ашигтай байдаг.
● Олон өнгийн үр дүнг тайлбарлах: Олон өнгийн урсгалын цитометрийн тэмдэглэгээ бүр нь гэрлийн тодорхой долгионы уртаар өдөөгдөж, янз бүрийн эсийн төрөл эсвэл төлөвийг нарийн ялгах боломжийг олгодог. Энэ нь дархлааны эсийн профайлыг тодорхойлох, хорт хавдрын судалгаа болон олон маркерыг нэгэн зэрэг шинжлэх шаардлагатай бусад салбарт тустай.
Тэмдэглэгээний төрөл |
Фторхром Ашигласан |
Нийтлэг хэрэглээ |
CD3 (Т эсүүд) |
FITC, PE, APC |
Дархлааны профайлыг тодорхойлоход Т лимфоцитуудыг тодорхойлох. |
CD4 (туслах Т эсүүд) |
PerCP-Cy5.5, APC |
Дархлааны үйл ажиллагаанд туслах Т эсийг тодорхойлох. |
CD8 (цитотоксик Т эсүүд) |
PE, APC, BV421 |
Дархлааны хариу урвал дахь цитотоксик Т эсийг тодорхойлох. |
CD19 (В эсүүд) |
FITC, PE, PerCP |
Дархлаа судлал, лейкемийн судалгаанд В эсийг тодорхойлох. |
дуулнаComplex Data-д PCA, SPADE, tSNE-г
Урсгалын цитометрийн өгөгдөл нь ихэвчлэн олон параметрүүдийг агуулдаг бөгөөд энэ нь өндөр хэмжээст өгөгдлийн багц үүсгэдэг. Эдгээр цогц өгөгдлийн багцыг үр дүнтэй шинжлэхийн тулд судлаачид мэдээллийн шинжилгээний дэвшилтэт техникийг ашигладаг:
● Үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн шинжилгээ (PCA): PCA нь аль болох их мэдээллийг хадгалахын зэрэгцээ том өгөгдлийн багцын хэмжээст байдлыг багасгахад ашигладаг статистик арга юм. Энэ нь олон хувьсагчийн хоорондын зүй тогтол, хамаарлыг тодорхойлоход тусалдаг ба нарийн төвөгтэй өгөгдлийг дүрслэн харуулахад хялбар болгодог.
● SPADE (Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events): SPADE нь нэг төрлийн бус популяци доторх эсийн дэд популяци дээр анхаарлаа төвлөрүүлж том өгөгдлийн багцыг шинжлэхэд ашигладаг арга юм. Энэ арга нь судлаачдад эсийн популяцийн динамикийг цаг хугацааны явцад эсвэл эмчилгээний хариу урвалаар судлах боломжийг олгодог.
● tSNE (t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding): tSNE нь өгөгдлийн хэмжээст байдлыг багасгахад ашигладаг алгоритм бөгөөд өндөр хэмжээст орон зай дахь нүднүүдийн хоорондын харилцааг дүрслэн харуулахад хялбар болгодог. Энэ нь ижил төстэй шинж чанартай эсүүдийг бөөгнөрөлд оруулахад онцгой ач холбогдолтой юм.
Эдгээр дэвшилтэт техникүүд нь судлаачдад урсгалын цитометрийн нарийн төвөгтэй өгөгдлөөс утга учиртай ойлголтыг гаргаж авах, том өгөгдлийн багцын тайлбарыг хөнгөвчлөх боломжийг олгодог.
Үр дүнг тайлбарлах
Эрүүл эс болон хэвийн бус эсийг тодорхойлох
Урсгалын цитометрийг хорт хавдрын оношлогоо гэх мэт эсийн хэвийн бус байдлыг илрүүлэх зорилгоор эмнэлзүйн орчинд өргөн ашигладаг. Флюресценц ба тархалтын хэв маягийг харьцуулснаар та эрүүл эсүүд болон хэвийн бус шинж чанартай эсүүдийг ялгаж чадна.
Жишээ нь:
● Хорт хавдар илрүүлэх: Хавдар судлалын хувьд урсгалын цитометрийг ихэвчлэн хорт хавдрын эсүүдэд тохиолддог өвөрмөц гадаргуугийн маркер эсвэл ДНХ-ийн агууламжийн өөрчлөлтийг хайх замаар хорт хавдрын эсийг тодорхойлоход ашигладаг.
● Дархлааны эсийн профайлыг тодорхойлох: Урсгалын цитометрийг мөн дархлааны эсүүдэд дүн шинжилгээ хийх, идэвхжүүлсэн, санах ой эсвэл дархлааны хариу урвал дахь зохицуулалтын Т эсийг тодорхойлоход ашиглаж болох бөгөөд энэ нь дархлааны үйл ажиллагаа эсвэл өвчний явцыг хянахад тусалдаг.
Эерэг ба сөрөг хяналтыг ойлгох
Таны үр дүнгийн үнэн зөвийг баталгаажуулахын тулд туршилтдаа эерэг ба сөрөг хяналтыг зөв оруулах нь чухал юм.
● Эерэг хяналт: Шинжилгээ нь хүлээгдэж буйгаар ажиллаж байгаа эсэхийг баталгаажуулах тодорхой тэмдэглэгээний илэрхийлэлийг харуулсан дээж.
● Сөрөг хяналт: Тэмдэглэгчийн илэрхийлэлийг харуулахгүй байхын тулд тэмдэглэгээг илэрхийлэх, артерийн флюпсиональ мэдээллийг илрүүлэх дээж.
Хяналт нь таны өгөгдлийн үнэн зөвийг баталгаажуулж, ажигласан үр дүн нь таны судалж буй биологийн үзэгдлийг бодитоор тусгаж байгаа эсэхийг баталгаажуулахад амин чухал юм.
Урсгалын цитометрийн өгөгдлийг тайлбарлах практик зөвлөмжүүд
Зохих хяналтыг оруулна уу
Урсгалын цитометрийн туршилтанд хяналтыг оруулах нь үнэн зөв мэдээлэл олж авахад зайлшгүй шаардлагатай. Хяналт нь дараахад тусална:
● Ашигласан флюресцент тэмдэглэгээний үр нөлөөг баталгаажуулах.
● Ажиглагдсан флюресценц нь зорилтот эсүүдэд хамаарах бөгөөд туршилтын олдвор эсвэл өвөрмөц бус холболтоос шалтгаалаагүй эсэхийг шалгаарай.
Туршилтын дизайныг ойлгох
Сайн зохион бүтээсэн туршилтууд нь таны цуглуулсан өгөгдлийг утга учиртай, дахин давтагдахуйц байлгахад маш чухал юм. Туршилт хийхдээ дараахь зүйлийг анхаарч үзээрэй.
● Дээж бэлтгэх: Дээжийг зөв боловсруулах нь хэлбэлзлийг багасгахад чухал үүрэгтэй. Жишээлбэл, таны эсүүд нэг эсийн суспензид байгаа эсэхийг шалгах нь үнэн зөв дүн шинжилгээ хийхэд маш чухал юм.
● Самбарын загвар: Маркер болон флюрохромыг сонгохдоо туршилтын зорилгод тулгуурлана. Жишээлбэл, хэрэв та дархлааны эсийн популяцид дүн шинжилгээ хийх сонирхолтой байгаа бол өөр өөр Т эсийн дэд бүлгүүдийг тусгайлан тодорхойлох маркеруудыг сонго.
Байгуулах
Урсгалын цитометрийн үр дүнг уншиж, тайлбарлах нь технологи, арга, биологийн нөхцөл байдлын талаар тодорхой ойлголттой байхыг шаарддаг. Урсгалын цитометрийн үндсийг эзэмшсэнээр, өгөгдлийн дэвшилтэт дүн шинжилгээ, туршилтын зөв загварыг эзэмшсэнээр та шинжлэх ухааны нээлт, эмнэлзүйн шийдвэрийг гаргах үнэ цэнэтэй ойлголтыг олж авах боломжтой. Хорт хавдрын судалгаа, дархлаа судлал, оношилгооны чиглэлээр ажиллаж байгаа эсэхээс үл хамааран урсгалын цитометрийн өгөгдлийг тайлбарлах нь илүү сайн эмчилгээ, өвчтөний үр дүнг сайжруулахад чиглэсэн мэдээлэлтэй шийдвэр гаргахад зайлшгүй шаардлагатай. Судалгаа, эмнэлзүйн шинжилгээгээ сайжруулахыг эрэлхийлж буй хүмүүст зориулсан бүтээгдэхүүн HKeybio нь урсгалын цитометрийн хэрэглээг сайжруулах өвөрмөц шийдлүүдийг санал болгож, өгөгдлийг нарийн тайлбарлах, эсийн шинжилгээ хийхэд үнэ цэнэтэй хэрэгслээр хангадаг.
Түгээмэл асуултууд
А: Урсгалын цитометр гэж юу вэ?
Х: Урсгалын цитометр нь эс эсвэл бөөмсийг лазер туяагаар дамжуулж тэдгээрийн физик, химийн шинж чанарыг шинжлэхэд ашигладаг арга юм. Энэ нь хэмжээ, нарийн төвөгтэй байдал, тэмдэглэгээний талаархи мэдээллийг цуглуулахын тулд гэрлийн тархалт, флюресценцийг хэмждэг.
А: Урсгалын цитометрийн үр дүнг хэрхэн тайлбарлах вэ?
Х: Урсгалын цитометрийн үр дүнг тайлбарлахын тулд хэмжээ, нарийн төвөгтэй байдал, тэмдэглэгээний илэрхийлэлд тулгуурлан эсийн популяцийг тодорхойлохын тулд гэрлийн тархалтын өгөгдөл (урагш ба хажуугийн тархалт) болон флюресценцийн эрчимд анхаарлаа хандуулаарай.
А: Урсгалын цитометрийн гарцын стратеги гэж юу вэ?
Х: Урсгалын цитометрийн гарц нь тархалт эсвэл флюресценцийн шинж чанарт үндэслэн тодорхой эсийн популяцийг тусгаарлах үйл явц бөгөөд илүү нарийвчилсан дүн шинжилгээ хийх боломжийг олгодог.
Асуулт: Олон өнгийн урсгалын цитометр яагаад хэрэгтэй вэ?
Х: Олон өнгийн урсгалын цитометр нь нэг дээжинд олон тэмдэглэгээг нэгэн зэрэг шинжлэх боломжийг олгож, эсийн популяци, тэдгээрийн шинж чанарын талаар илүү дэлгэрэнгүй ойлголтыг өгдөг.
А: Урсгалын цитометр нь хорт хавдрын судалгаанд хэрхэн туслах вэ?
Х: Урсгалын цитометр нь хорт хавдрын тодорхой маркеруудыг тодорхойлох, хавдрын шинж чанарыг шинжлэхэд тусалж, оношилгоо, прогноз, эмчилгээний хяналтад үнэ цэнэтэй ойлголтыг өгдөг.
