Zavedení
Přemýšleli jste někdy jak průtoková cytometrie dosahuje tak přesné a spolehlivé buněčné analýzy? Klíč k přesným výsledkům spočívá ve správné fixaci buněk. Průtoková cytometrie umožňuje výzkumníkům studovat různé buněčné charakteristiky, od velikosti po intenzitu fluorescence. Bez správné fixace však data nemusí odrážet skutečné buněčné vlastnosti. V tomto článku prozkoumáme důležitost fixace buněk v průtokové cytometrii, probereme různé metody fixace a podělíme se o tipy pro optimální výsledky.
Co je fixace buněk v průtokové cytometrii?
Definice buněčné fixace
Fixace buněk je proces, který stabilizuje a uchovává buňky tím, že brání změnám v jejich struktuře, funkci a molekulárním složení. Tohoto procesu je dosaženo chemickým zesíťováním proteinů, lipidů a dalších buněčných složek, které účinně 'zmrazí' buňky v jejich aktuálním stavu. To je zvláště důležité v průtokové cytometrii, protože to zabraňuje degradaci buněčných markerů nebo změně buněčných struktur během analýzy. Fixací buněk mohou vědci zajistit, že charakteristiky buněk zůstanou konzistentní, což umožňuje přesná měření a spolehlivá data během analýzy průtokové cytometrie.
Proč je fixace důležitá
Správná fixace je nezbytná, protože zachovává integritu buněčných proteinů a nukleových kyselin, které jsou klíčové pro přesnou analýzu průtokovou cytometrií. Pokud buňky nejsou fixovány, jejich struktura a molekulární markery se mohou časem degradovat nebo změnit, což vede k nespolehlivým a nepřesným výsledkům. Fixace také hraje klíčovou roli při stabilizaci buněk pro multiparametrovou analýzu, což je jedna z klíčových silných stránek průtokové cytometrie. Umožňuje výzkumníkům současně hodnotit více buněčných vlastností, jako jsou povrchové markery, intracelulární proteiny a obsah DNA, v jediném experimentu. Bez správné fixace by mohla být získaná data nekonzistentní nebo neúplná, což by vedlo k nesprávné interpretaci experimentálních výsledků.
Typy fixačních metod pro průtokovou cytometrii
Fixace paraformaldehydem (PFA).
Paraformaldehyd (PFA) je jedním z nejpoužívanějších fixativů v průtokové cytometrii, především díky své účinnosti při zachování buněčné morfologie a antigenicity. Funguje tak, že zesíťuje proteiny v buňkách a zajišťuje, že jak buněčná struktura, tak povrchové proteiny zůstanou nedotčeny. Díky tomu je PFA vynikající volbou pro zachování markerů buněčného povrchu, zejména při analýze exprese povrchových proteinů v imunofenotypizačních experimentech.
Doporučení:
● Koncentrace: Pro optimální fixaci se běžně používá 2-4% PFA.
● Doba fixace: Buňky by měly být inkubovány v PFA po dobu 15-30 minut při 2-8°C.
● Skladování: Po fixaci by měly být buňky skladovány při 2-8°C pro krátkodobé skladování. Je důležité neskladovat fixované buňky po delší dobu, protože to může vést ke ztrátě integrity markeru.
Je důležité zabránit nadměrné fixaci, protože prodloužená expozice PFA může vést k buněčné autofluorescenci a interferovat s následným barvením a analýzou. Vždy používejte minimální požadovaný čas pro fixaci.
Fixace ethanolem
Fixace etanolem se běžně používá, když se analýza zaměřuje na obsah DNA, jako například ve studiích buněčného cyklu. Ethanol je dehydratační činidlo, které působí tak, že proniká buněčnou membránou a zachovává DNA v buňkách. Díky tomu je fixace ethanolu zvláště užitečná pro testy založené na DNA a analýzy průtokové cytometrie, kde se zkoumají fáze buněčného cyklu nebo obsah DNA.
Doporučení:
● Koncentrace: Obvykle se používá 70-100% etanol.
● Doba fixace: Fixace etanolem obvykle vyžaduje 10-15 minut pro dosažení optimálních výsledků.
Ethanolová fixace je ideální pro zachování fází buněčného cyklu a lze ji použít v kombinaci s barvivy vázajícími DNA, jako je propidium jodid (PI) pro analýzu buněčného cyklu.
Fixace metanolem
Metanol je dalším běžně používaným fixativem, zejména pro intracelulární analýzy. Funguje tak, že proniká buněčnou membránou a stabilizuje vnitřní struktury buňky. Zatímco methanol je účinný při ochraně buněčných proteinů a antigenů, může způsobit smršťování buněk, což může ovlivnit interpretaci určitých znaků, jako je velikost a morfologie buněk.
Doporučení:
● Koncentrace: Obvykle se používá 90-100% methanol.
● Doba fixace: Obvykle stačí 10-15 minut.
Fixace metanolem se často používá při studiu intracelulárních proteinů, zejména při zkoumání markerů uvnitř cytoplazmy nebo jádra. Vědci by však měli zvážit možnost smršťování buněk při použití fixace metanolem.
Další fixační prostředky (např. formalín)
Formalín, roztok formaldehydu ve vodě, je dalším fixačním prostředkem používaným v průtokové cytometrii, i když je méně běžný než PFA. Formalin je široce používán v histologii a imunohistochemii, kde účinně uchovává vzorky tkání pro mikroskopickou analýzu. Ačkoli formalín může zachovat buněčné struktury, obecně se nedoporučuje pro průtokovou cytometrii, pokud se nepracuje s fixovanými vzorky tkáně, protože může interferovat s tříděním buněk a některými fluorescenčními aplikacemi. Formalínová fixace je nejvhodnější pro vzorky tkáně, nikoli pro jednotlivé buňky.
Fixační prostředek |
Koncentrace |
Doba fixace |
Doporučené použití |
paraformaldehyd (PFA) |
2–4 % |
15-30 minut |
Ideální pro uchování markerů buněčného povrchu; běžné pro imunofenotypizaci |
Ethanol |
70–100 % |
10-15 minut |
Nejlepší pro analýzu obsahu DNA a studie buněčného cyklu |
methanol |
90–100 % |
10-15 minut |
Vhodné pro intracelulární proteinovou analýzu; může způsobit smrštění buněk |
Formalín |
10% (formaldehyd) |
Liší se (závisí na tkáni) |
Obecně se používá pro vzorky fixované tkáně, nikoli pro jednotlivé buňky |
Podrobný průvodce fixací buněk pro průtokovou cytometrii
Příprava vzorku buňky
Před fixací je nezbytné izolovat buňky ze vzorku tkáně nebo krve. Centrifugace je nejběžnější metodou používanou pro koncentraci buněk v suspenzi. Je také důležité buňky důkladně omýt, aby se odstranila všechna kultivační média nebo zbytkové kontaminanty, které by mohly narušovat proces fixace.
1. Izolace buněk: K oddělení požadovaných buněk použijte standardní izolační metody, jako je centrifugace nebo třídění buněk.
2. Promytí: Promyjte buňky fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS), abyste odstranili zbytkové médium a kontaminanty, které by mohly ovlivnit proces fixace.
Postup fixace
Jakmile jsou buňky připraveny, dalším krokem je přidání fixačního činidla do buněčné suspenze. Nejčastěji používaným fixativem pro průtokovou cytometrii je 2-4% roztok PFA.
1. Přidejte fixační prostředek do buněčné suspenze a ujistěte se, že je dobře promíchán.
2. Inkubujte buňky s fixativem po dobu 15-30 minut při 2-8°C.
3. Po inkubaci promyjte buňky dvakrát PBS, abyste odstranili přebytečný fixativ.
Kroky po fixaci
Po fixaci je třeba s buňkami zacházet opatrně. Pokud je nutná další analýza, měly by být buňky před analýzou obarveny. Pokud plánujete uchovat buňky pro budoucí analýzu, resuspendujte je ve vhodném pufru a skladujte je při 2-8°C. Nenechávejte buňky ve fixativu po dlouhou dobu, protože přílišná fixace může vést ke zvýšené autofluorescenci a snížení kvality signálu.
Tipy pro optimální fixaci v průtokové cytometrii
Předcházení nadměrné fixaci
K nadměrné fixaci dochází, když jsou buňky vystaveny fixativu příliš dlouho, což může vést k nadměrnému zesíťování buněčných proteinů a ohrozit kvalitu dat. To může vést k autofluorescenci, snížené vazbě protilátek a nepřesným měřením průtokovou cytometrií. Vždy zkontrolujte doporučené doby fixace pro váš konkrétní typ buněk a experimentujte, abyste se vyhnuli nadměrné fixaci.
Doba fixace vs. typ vzorku
Optimální doba fixace se může lišit v závislosti na typu buňky a povaze experimentu. Například imunitní buňky mohou vyžadovat kratší dobu fixace než vzorky tkáně. Upravte dobu fixace na základě specifických potřeb typu vzorku. Pro analýzu povrchových proteinů obvykle postačuje kratší doba fixace (10-15 minut). Pro intracelulární barvení nebo analýzu DNA může být vyžadována delší doba fixace.
Barvení po fixaci
Po fixaci buněk je barvení protilátkami nebo fluorescenčními barvivy kritickým krokem v analýze průtokovou cytometrií. Některá fluorescenční barviva, zejména tandemová barviva, mohou být citlivá na fixaci a mohou degradovat, pokud jsou buňky příliš fixovány. Pro optimální výsledky barvení se doporučuje obarvit buňky před fixací, kdykoli je to možné. To může pomoci zabránit degradaci barviva a zajistit silnější fluorescenční signály.
Ukládání fixních buněk pro průtokovou cytometrii
Krátkodobé skladování
Pro krátkodobé skladování lze fixované buňky uchovávat v chladničce při 2-8°C. To je ideální, pokud plánujete analyzovat buňky během jednoho nebo dvou dnů po fixaci. Fixované buňky vždy skladujte ve tmě, abyste zabránili vyblednutí světlem, které může ovlivnit fluorescenční signály.
Dlouhodobé skladování
Pro dlouhodobé skladování lze buňky zmrazit v kryokonzervačním médiu. Typické kryokonzervační médium se skládá z 10 % dimethylsulfoxidu (DMSO) a 90 % fetálního bovinního séra (FBS). K dispozici jsou však také kryokonzervační roztoky bez séra, jako je mFreSR™ nebo CryoStor™ CS10, které lze použít k zabránění problémům spojeným s FBS. Chcete-li zabránit tvorbě ledových krystalů, použijte k zmrazení buněk mrazničku s řízenou rychlostí. To pomáhá udržovat životaschopnost buněk a zajišťuje správné skladování.
Běžná úskalí, kterým je třeba se vyhnout při fixaci buněk pro průtokovou cytometrii
Účinky nesprávné fixace
Nesprávná fixace může vést k několika problémům, včetně autofluorescence, snížené vazby protilátek a špatné životaschopnosti buněk. Tyto problémy mohou významně ovlivnit přesnost a spolehlivost výsledků průtokové cytometrie. Vždy ověřte fixační protokoly pro váš konkrétní typ vzorku a ujistěte se, že podmínky fixace jsou vhodné pro typ buněk a analyzované markery.
Výběr správného fixačního prostředku pro vaši aplikaci
Výběr vhodného fixačního prostředku pro váš experiment s průtokovou cytometrií je zásadní pro získání spolehlivých a přesných výsledků. Různé fixativy jsou vhodnější pro různé aplikace. Například PFA se běžně používá pro analýzu povrchových proteinů, zatímco etanol je ideální pro studie založené na DNA. Před zahájením experimentu prozkoumejte nejlepší fixativ pro vaši konkrétní aplikaci a podle toho upravte fixační protokol.
Závěr
Pro dosažení úspěšné analýzy průtokovou cytometrií je nezbytná správná fixace buněk. Pomáhá zachovat buněčné struktury a zajišťuje integritu proteinů a DNA. Dodržováním správných fixačních protokolů a vyhýbáním se nadměrné fixaci mohou výzkumníci zvýšit přesnost a spolehlivost dat. Výběr vhodného fixačního prostředku pro váš experiment zlepšuje celkovou kvalitu vašich výsledků. Implementace těchto osvědčených postupů zajišťuje, že vaše analýza průtokovou cytometrií poskytuje konzistentní, reprodukovatelné poznatky o buněčných funkcích.
Správná fixace buněk hraje klíčovou roli v průtokové cytometrii a produkty z HKeybio nabízí spolehlivá řešení. Jejich nabídka zajišťuje vysoce kvalitní výsledky a výzkumníci na celém světě jim důvěřují pro přesnou analýzu buněk.
FAQ
Otázka: Jaký je význam fixace buněk v průtokové cytometrii?
Odpověď: Fixace buněk je v průtokové cytometrii klíčová, protože zachovává buněčné struktury a zajišťuje integritu proteinů a DNA pro přesnou analýzu.
Otázka: Jak dlouho by měly být buňky fixovány pro průtokovou cytometrii?
Odpověď: Buňky by měly být obvykle fixovány po dobu 15-30 minut 2-4% roztokem paraformaldehydu (PFA), aby byla zachována buněčná integrita.
Otázka: Mohu použít ethanol pro fixaci buněk v průtokové cytometrii?
Odpověď: Ano, fixace ethanolem se běžně používá pro analýzu obsahu DNA v průtokové cytometrii, zejména pro studie buněčného cyklu.
Otázka: Co se stane, když jsou buňky v průtokové cytometrii příliš fixovány?
Odpověď: Nadměrná fixace může způsobit nadměrné zesítění, což vede k autofluorescenci a špatné vazbě protilátky, což může ovlivnit výsledky průtokové cytometrie.
