Introduksjon
Har du noen gang lurt på hvordan flowcytometri oppnår en så presis og pålitelig celleanalyse? Nøkkelen til nøyaktige resultater ligger i riktig cellefiksering. Flowcytometri lar forskere studere en rekke cellulære egenskaper, fra størrelse til fluorescensintensitet. Men uten riktig fiksering kan det hende at dataene ikke gjenspeiler sanne cellulære egenskaper. I denne artikkelen vil vi utforske viktigheten av cellefiksering i flowcytometri, diskutere forskjellige fikseringsmetoder og dele tips for optimale resultater.
Hva er cellefiksering i flowcytometri?
Definisjon av cellefiksering
Cellefiksering er en prosess som stabiliserer og bevarer cellene ved å forhindre endringer i deres struktur, funksjon og molekylære sammensetning. Denne prosessen oppnås ved å kjemisk tverrbinde proteiner, lipider og andre cellulære komponenter, og effektivt 'fryse' cellene i deres nåværende tilstand. Dette er spesielt viktig i flowcytometri fordi det forhindrer nedbrytning av cellulære markører eller endring av cellulære strukturer under analysen. Ved å fikse cellene kan forskerne sikre at egenskapene til cellene forblir konsistente, noe som muliggjør presise målinger og pålitelige data under flowcytometrianalyse.
Hvorfor fiksering er viktig
Riktig fiksering er viktig fordi den opprettholder integriteten til cellulære proteiner og nukleinsyrer, som er avgjørende for nøyaktig flowcytometrianalyse. Hvis cellene ikke er fiksert, kan deres struktur og molekylære markører brytes ned eller endre seg over tid, noe som fører til upålitelige og unøyaktige resultater. Fiksering spiller også en kritisk rolle i å stabilisere celler for multi-parameter analyse, som er en av nøkkelstyrkene til flowcytometri. Det lar forskere vurdere flere cellefunksjoner samtidig, som overflatemarkører, intracellulære proteiner og DNA-innhold, i et enkelt eksperiment. Uten riktig fiksering kan de oppnådde dataene være inkonsekvente eller ufullstendige, noe som fører til feiltolkning av de eksperimentelle resultatene.
Typer av fikseringsmetoder for flowcytometri
Paraformaldehyd (PFA) fiksering
Paraformaldehyd (PFA) er et av de mest brukte fikseringsmidlene i flowcytometri, først og fremst på grunn av dets effektivitet i å bevare cellemorfologi og antigenisitet. Det fungerer ved å tverrbinde proteiner i cellene, og sikrer at både cellestrukturen og overflateproteinene forblir intakte. Dette gjør PFA til et utmerket valg for å bevare celleoverflatemarkører, spesielt når man analyserer overflateproteinuttrykk i immunfenotypingseksperimenter.
Anbefaling:
● Konsentrasjon: 2-4 % PFA brukes vanligvis for optimal fiksering.
● Fikseringstid: Celler bør inkuberes i PFA i 15-30 minutter ved 2-8°C.
● Oppbevaring: Etter fiksering bør cellene oppbevares ved 2-8°C for korttidslagring. Det er viktig å ikke lagre faste celler i lengre perioder, da dette kan føre til tap av markørintegritet.
Det er viktig å unngå overfiksering, da langvarig eksponering for PFA kan føre til cellulær autofluorescens og forstyrre påfølgende farging og analyse. Bruk alltid den minimale nødvendige tiden for fiksering.
Etanolfiksering
Etanolfiksering brukes ofte når fokuset i analysen er på DNA-innhold, for eksempel i cellesyklusstudier. Etanol er et dehydrerende middel som virker ved å penetrere cellemembranen og bevare DNA i cellene. Dette gjør etanolfiksering spesielt nyttig for DNA-baserte analyser og flowcytometrianalyser der cellesyklusstadier eller DNA-innhold undersøkes.
Anbefaling:
● Konsentrasjon: Vanligvis brukes 70-100 % etanol.
● Fikseringstid: Etanolfiksering krever vanligvis 10-15 minutter for optimale resultater.
Etanolfiksering er ideell for å bevare cellesyklusfaser, og den kan brukes i kombinasjon med DNA-bindende fargestoffer som propidiumjodid (PI) for cellesyklusanalyse.
Metanolfiksering
Metanol er et annet ofte brukt fikseringsmiddel, spesielt for intracellulære analyser. Det virker ved å penetrere cellemembranen og stabilisere cellens indre strukturer. Mens metanol er effektivt for å bevare cellulære proteiner og antigener, kan det forårsake cellekrymping, noe som kan påvirke tolkningen av visse funksjoner, for eksempel cellestørrelse og morfologi.
Anbefaling:
● Konsentrasjon: Vanligvis brukes 90-100 % metanol.
● Fikseringstid: 10-15 minutter er vanligvis tilstrekkelig.
Metanolfiksering brukes ofte når man studerer intracellulære proteiner, spesielt når man undersøker markører inne i cytoplasmaet eller kjernen. Imidlertid bør forskere vurdere potensialet for cellekrymping ved bruk av metanolfiksering.
Andre fikseringsmidler (f.eks. formalin)
Formalin, en løsning av formaldehyd i vann, er et annet fikseringsmiddel som brukes i flowcytometri, selv om det er mindre vanlig enn PFA. Formalin er mye brukt i histologi og immunhistokjemi, hvor det effektivt bevarer vevsprøver for mikroskopisk analyse. Selv om formalin kan bevare cellestrukturer, anbefales det generelt ikke for flowcytometri med mindre man arbeider med faste vevsprøver, da det kan forstyrre cellesortering og enkelte fluorescensapplikasjoner. Formalinfiksering er best egnet for vevsprøver, ikke for individuelle celler.
Fiksativ |
Konsentrasjon |
Fikseringstid |
Anbefalt bruk |
Paraformaldehyd (PFA) |
2-4 % |
15-30 minutter |
Ideell for å bevare celleoverflatemarkører; vanlig for immunfenotyping |
Etanol |
70–100 % |
10-15 minutter |
Best for DNA-innholdsanalyse og cellesyklusstudier |
Metanol |
90–100 % |
10-15 minutter |
Egnet for intracellulær proteinanalyse; kan forårsake cellekrymping |
Formalin |
10 % (formaldehyd) |
Varierer (avhengig av vev) |
Vanligvis brukt for fikserte vevsprøver, ikke for individuelle celler |
Trinn-for-trinn veiledning for å fikse celler for flytcytometri
Klargjøring av celleprøven
Før fiksering er det viktig å isolere cellene fra vevet eller blodprøven. Sentrifugering er den vanligste metoden som brukes for å konsentrere celler i en suspensjon. Det er også viktig å vaske cellene grundig for å fjerne kulturmedier eller gjenværende forurensninger som kan forstyrre fikseringsprosessen.
1. Celleisolering: Bruk standard isolasjonsmetoder som sentrifugering eller cellesortering for å skille cellene av interesse.
2. Vask: Vask cellene med fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne gjenværende media og forurensninger som kan påvirke fikseringsprosessen.
Fikseringsprosedyre
Når cellene er forberedt, er neste trinn å legge fikseringsmidlet til cellesuspensjonen. Det mest brukte fikseringsmidlet for flowcytometri er en 2-4 % PFA-løsning.
1. Tilsett fikseringsmidlet til cellesuspensjonen, og sørg for at det er godt blandet.
2. Inkuber cellene med fikseringsmidlet i 15-30 minutter ved 2-8°C.
3. Etter inkubasjonen, vask cellene to ganger med PBS for å fjerne overflødig fikseringsmiddel.
Trinn etter fiksering
Etter fiksering må cellene håndteres forsiktig. Hvis ytterligere analyse er nødvendig, bør cellene farges før analyse. Hvis du planlegger å lagre cellene for fremtidig analyse, resuspender dem i en passende buffer og oppbevar dem ved 2-8 °C. Unngå å la celler ligge i fikseringsmidlet i lange perioder, da overfiksering kan føre til økt autofluorescens og redusert signalkvalitet.
Tips for optimal fiksering i flowcytometri
Unngå overfiksering
Overfiksering oppstår når cellene eksponeres for fikseringsmidlet for lenge, noe som kan resultere i overdreven kryssbinding av cellulære proteiner og kompromittere kvaliteten på dataene. Dette kan føre til autofluorescens, redusert antistoffbinding og unøyaktige flowcytometrimålinger. Sjekk alltid de anbefalte fikseringstidene for din spesifikke celletype og eksperiment for å unngå overfiksering.
Fikseringstid vs. prøvetype
Den optimale fikseringstiden kan variere avhengig av celletypen og eksperimentets art. For eksempel kan immunceller kreve kortere fikseringstider enn vevsprøver. Juster fikseringstiden basert på de spesifikke behovene til prøvetypen. For overflateproteinanalyse er en kortere fikseringstid (10-15 minutter) vanligvis tilstrekkelig. For intracellulær farging eller DNA-analyse kan det være nødvendig med lengre fikseringstid.
Farging etter fiksering
Etter fiksering av cellene er farging med antistoffer eller fluorescerende fargestoffer et kritisk trinn i flowcytometrianalyse. Noen fluorescerende fargestoffer, spesielt tandemfarger, kan være følsomme for fiksering og kan brytes ned hvis cellene er overfiksert. For optimale fargeresultater anbefales det å farge cellene før fiksering når det er mulig. Dette kan bidra til å forhindre nedbrytning av fargestoff og sikre sterkere fluorescenssignaler.
Lagring av faste celler for flytcytometri
Korttidslagring
For korttidslagring kan fikserte celler oppbevares i kjøleskap ved 2-8°C. Dette er ideelt når du planlegger å analysere cellene innen en dag eller to etter fiksering. Oppbevar alltid faste celler i mørket for å forhindre fotobleking, noe som kan påvirke de fluorescerende signalene.
Langtidslagring
For langtidslagring kan cellene fryses i kryokonserveringsmedier. Et typisk kryokonserveringsmedium består av 10 % dimetylsulfoksid (DMSO) og 90 % føtalt bovint serum (FBS). Serumfrie kryokonserveringsløsninger som mFreSR™ eller CryoStor™ CS10 er imidlertid også tilgjengelige og kan brukes for å unngå problemer forbundet med FBS. For å forhindre iskrystalldannelse, bruk en fryser med kontrollert hastighet for å fryse cellene. Dette bidrar til å opprettholde cellenes levedyktighet og sikrer riktig lagring.
Vanlige fallgruver å unngå ved cellefiksering for flowcytometri
Effekter av feil fiksering
Feil fiksering kan føre til flere problemer, inkludert autofluorescens, redusert antistoffbinding og dårlig cellelevedyktighet. Disse problemene kan i betydelig grad påvirke nøyaktigheten og påliteligheten til flowcytometriresultater. Kontroller alltid fikseringsprotokoller for din spesifikke prøvetype, og sørg for at fikseringsforholdene er passende for celletypen og markørene som analyseres.
Velge riktig fikseringsmiddel for applikasjonen din
Å velge riktig fikseringsmiddel for flowcytometrieksperimentet er avgjørende for å oppnå pålitelige og nøyaktige resultater. Ulike fikseringsmidler er bedre egnet for ulike bruksområder. For eksempel er PFA ofte brukt for overflateproteinanalyse, mens etanol er ideell for DNA-baserte studier. Før du starter eksperimentet, undersøk det beste fikseringsmidlet for din spesifikke applikasjon og juster fikseringsprotokollen deretter.
Konklusjon
Riktig cellefiksering er avgjørende for å oppnå vellykket flowcytometrianalyse. Det bidrar til å bevare cellulære strukturer og sikrer integriteten til proteiner og DNA. Ved å følge riktige fikseringsprotokoller og unngå overfiksering, kan forskere forbedre datanøyaktigheten og påliteligheten. Å velge riktig fikseringsmiddel for eksperimentet forbedrer den generelle kvaliteten på resultatene. Implementering av disse beste praksisene sikrer at flowcytometrianalysen din gir konsistent, reproduserbar innsikt i cellulære funksjoner.
Riktig cellefiksering spiller en nøkkelrolle i flowcytometri, og produkter fra HKeybio tilbyr pålitelige løsninger. Tilbudene deres sikrer resultater av høy kvalitet og er pålitelige av forskere over hele verden for nøyaktig celleanalyse.
FAQ
Spørsmål: Hva er viktigheten av cellefiksering i flowcytometri?
Sv: Cellefiksering er avgjørende i flowcytometri da den bevarer cellulære strukturer og sikrer integriteten til proteiner og DNA for nøyaktig analyse.
Spørsmål: Hvor lenge skal celler fikseres for flowcytometri?
A: Celler bør vanligvis fikseres i 15-30 minutter med en 2-4% paraformaldehyd (PFA)-løsning for å opprettholde cellulær integritet.
Spørsmål: Kan jeg bruke etanol for cellefiksering i flowcytometri?
A: Ja, etanolfiksering brukes ofte for DNA-innholdsanalyse i flowcytometri, spesielt for cellesyklusstudier.
Spørsmål: Hva skjer hvis cellene er overfiksert i flowcytometri?
A: Overfiksering kan forårsake overdreven kryssbinding, noe som fører til autofluorescens og dårlig antistoffbinding, noe som kan påvirke flowcytometriresultater.
