Кіріспе
Қалай деп ойлап көрдіңіз бе? ағынды цитометрия осындай дәл және сенімді жасуша талдауына қол жеткізеді ме? Нақты нәтижелердің кілті жасушаның дұрыс бекітілуінде жатыр. Ағын цитометриясы зерттеушілерге өлшемнен флуоресценция қарқындылығына дейін әртүрлі жасушалық сипаттамаларды зерттеуге мүмкіндік береді. Дегенмен, тиісті бекітусіз деректер шынайы ұялы қасиеттерді көрсетпеуі мүмкін. Бұл мақалада біз ағынды цитометриядағы жасуша фиксациясының маңыздылығын зерттейміз, әртүрлі бекіту әдістерін талқылаймыз және оңтайлы нәтижелер алу үшін кеңестермен бөлісеміз.
Ағындық цитометриядағы жасушаны бекіту дегеніміз не?
Жасуша фиксациясының анықтамасы
Жасушаларды бекіту - бұл олардың құрылымын, функциясын және молекулалық құрамын өзгертуге жол бермеу арқылы жасушаларды тұрақтандыратын және сақтайтын процесс. Бұл процесс ақуыздарды, липидтерді және басқа жасушалық компоненттерді химиялық жолмен айқастырып, жасушаларды қазіргі күйінде тиімді түрде «мұздату» арқылы қол жеткізіледі. Бұл әсіресе ағын цитометриясында маңызды, себебі талдау кезінде жасушалық маркерлердің деградациясын немесе жасушалық құрылымдардың өзгеруін болдырмайды. Жасушаларды бекіту арқылы зерттеушілер жасушалардың сипаттамаларының тұрақты болуын қамтамасыз ете алады, бұл ағын цитометриясын талдау кезінде дәл өлшеулер мен сенімді деректерді алуға мүмкіндік береді.
Неліктен бекіту маңызды
Дұрыс фиксация өте маңызды, өйткені ол жасушалық ақуыздар мен нуклеин қышқылдарының тұтастығын сақтайды, олар дәл ағын цитометриясын талдау үшін өте маңызды. Егер жасушалар бекітілмесе, олардың құрылымы мен молекулалық маркерлері уақыт өте нашарлауы немесе өзгеруі мүмкін, бұл сенімсіз және дәл емес нәтижелерге әкеледі. Бекіту сонымен қатар ағын цитометриясының негізгі күшті жақтарының бірі болып табылатын көп параметрлі талдау үшін жасушаларды тұрақтандыруда маңызды рөл атқарады. Бұл зерттеушілерге бір экспериментте беткі маркерлер, жасушаішілік ақуыздар және ДНҚ мазмұны сияқты бірнеше жасуша ерекшеліктерін бір уақытта бағалауға мүмкіндік береді. Тиісті бекітусіз алынған деректер сәйкес келмеуі немесе толық болмауы мүмкін, бұл эксперимент нәтижелерін дұрыс түсіндірмеуге әкеледі.
Ағындық цитометрия үшін бекіту әдістерінің түрлері
Параформальдегидті (PFA) бекіту
Параформальдегид (PFA) ағынды цитометрияда ең көп қолданылатын фиксаторлардың бірі болып табылады, бұл ең алдымен жасуша морфологиясы мен антигенділігін сақтаудағы тиімділігіне байланысты. Ол жасуша құрылымы мен беткі белоктардың өзгеріссіз қалуын қамтамасыз ете отырып, жасушалардың ішіндегі ақуыздарды өзара байланыстыру арқылы жұмыс істейді. Бұл PFA-ны жасуша бетінің маркерлерін сақтау үшін тамаша таңдау жасайды, әсіресе иммунофенотиптеу эксперименттерінде беттік ақуыз экспрессиясын талдау кезінде.
Ұсыныс:
● Концентрация: Оңтайлы бекіту үшін әдетте 2-4% PFA қолданылады.
● Бекіту уақыты: жасушаларды 2-8°C температурада 15-30 минут ішінде PFA ішінде инкубациялау керек.
● Сақтау: Бекітілгеннен кейін ұяшықтарды қысқа мерзімді сақтау үшін 2-8°C температурада сақтау керек. Бекітілген ұяшықтарды ұзақ уақыт сақтамау маңызды, себебі бұл маркер тұтастығын жоғалтуға әкелуі мүмкін.
Шамадан тыс фиксацияны болдырмау маңызды, өйткені PFA ұзақ әсер ету жасушалық автофлуоресценцияға әкелуі және кейінгі бояу мен талдауға кедергі келтіруі мүмкін. Бекіту үшін әрқашан ең аз қажетті уақытты пайдаланыңыз.
Этанолды бекіту
Этанолды бекіту әдетте ДНҚ мазмұнына талдау жасағанда қолданылады, мысалы, жасушалық циклді зерттеуде. Этанол - жасуша мембранасына еніп, жасушалардағы ДНҚ-ны сақтау арқылы жұмыс істейтін құрғататын агент. Бұл этанолды бекітуді әсіресе ДНҚ негізіндегі талдаулар және жасуша циклінің кезеңдері немесе ДНҚ мазмұны зерттелетін ағынды цитометриялық талдаулар үшін пайдалы етеді.
Ұсыныс:
● Концентрация: Әдетте, 70-100% этанол пайдаланылады.
● Бекіту уақыты: оңтайлы нәтиже алу үшін этанолды бекіту әдетте 10-15 минутты қажет етеді.
Этанолды бекіту жасуша циклінің фазаларын сақтау үшін өте қолайлы және оны жасуша циклін талдау үшін пропидий йодид (PI) сияқты ДНҚ байланыстыратын бояғыштармен бірге пайдалануға болады.
Метанолды бекіту
Метанол - бұл әсіресе жасушаішілік талдаулар үшін жиі қолданылатын тағы бір бекіткіш. Ол жасуша мембранасына еніп, жасушаның ішкі құрылымдарын тұрақтандыру арқылы жұмыс істейді. Метанол жасушалық ақуыздар мен антигендерді сақтауда тиімді болғанымен, ол жасушаның кішіреюін тудыруы мүмкін, бұл жасуша өлшемі мен морфологиясы сияқты белгілі бір ерекшеліктерді түсіндіруге әсер етуі мүмкін.
Ұсыныс:
● Концентрация: Әдетте 90-100% метанол пайдаланылады.
● Бекіту уақыты: әдетте 10-15 минут жеткілікті.
Метанолды бекіту көбінесе жасушаішілік ақуыздарды зерттегенде, әсіресе цитоплазманың немесе ядроның ішіндегі маркерлерді зерттегенде қолданылады. Дегенмен, зерттеушілер метанолды бекітуді пайдаланған кезде жасушалардың қысқару мүмкіндігін ескеруі керек.
Басқа фиксаторлар (мысалы, формалин)
Формалин, формальдегидтің судағы ерітіндісі, ағынды цитометрияда қолданылатын тағы бір бекіткіш болып табылады, бірақ ол PFA-дан азырақ. Формалин гистологияда және иммуногистохимияда кеңінен қолданылады, мұнда микроскопиялық талдау үшін тін үлгілерін тиімді сақтайды. Формалин жасуша құрылымдарын сақтай алатын болса да, тіндердің бекітілген үлгілерімен жұмыс жасамайынша, әдетте ағынды цитометрия үшін ұсынылмайды, өйткені ол жасушаларды сұрыптауға және кейбір флуоресцентті қолданбаларға кедергі келтіруі мүмкін. Формалинді бекіту жеке жасушалар үшін емес, ұлпа үлгілері үшін ең қолайлы.
Бекіткіш |
Концентрация |
Бекіту уақыты |
Ұсынылатын пайдалану |
Параформальдегид (PFA) |
2-4% |
15-30 минут |
Жасуша бетінің маркерлерін сақтау үшін өте қолайлы; иммунофенотиптеу үшін ортақ |
Этанол |
70-100% |
10-15 минут |
ДНҚ мазмұнын талдау және жасушалық циклді зерттеу үшін ең жақсы |
Метанол |
90-100% |
10-15 минут |
Жасуша ішілік ақуызды талдау үшін қолайлы; жасушаның жиырылуын тудыруы мүмкін |
Формалин |
10% (формальдегид) |
Әртүрлі (тінге байланысты) |
Әдетте жеке жасушалар үшін емес, бекітілген тін үлгілері үшін қолданылады |
Ағындық цитометрия үшін жасушаларды бекіту бойынша қадамдық нұсқаулық
Жасуша үлгісін дайындау
Бекіту алдында жасушаларды тіннен немесе қан үлгісінен оқшаулау қажет. Центрифугалау - суспензиядағы жасушаларды концентрлеу үшін қолданылатын ең кең таралған әдіс. Бекіту процесіне кедергі келтіруі мүмкін кез келген қоректік ортаны немесе қалдық ластаушы заттарды жою үшін жасушаларды мұқият жуу өте маңызды.
1. Ұяшықты оқшаулау: Қызықты ұяшықтарды бөлу үшін центрифугалау немесе ұяшықтарды сұрыптау сияқты стандартты оқшаулау әдістерін пайдаланыңыз.
2. Жуу: Бекіту процесіне әсер етуі мүмкін қалдықтарды және ластаушы заттарды кетіру үшін жасушаларды фосфатты-буферлі тұзды ерітіндімен (PBS) жуыңыз.
Бекіту процедурасы
Жасушалар дайындалғаннан кейін келесі қадам жасуша суспензиясына фиксаторды қосу болып табылады. Ағынды цитометрия үшін ең жиі қолданылатын фиксатор 2-4% PFA ерітіндісі болып табылады.
1. Жасушалық суспензияға фиксаторды қосыңыз, оның жақсы араласқанына көз жеткізіңіз.
2. Жасушаларды фиксатормен 2-8°С температурада 15-30 минут инкубациялаңыз.
3. Инкубациядан кейін артық фиксаторды кетіру үшін жасушаларды екі рет PBS көмегімен жуыңыз.
Бекітуден кейінгі қадамдар
Бекітуден кейін жасушаларды мұқият өңдеу керек. Қосымша талдау қажет болса, талдау алдында жасушаларды бояу керек. Ұяшықтарды болашақ талдау үшін сақтауды жоспарласаңыз, оларды тиісті буферде қайта суспензияға салып, 2-8°C температурада сақтаңыз. Ұзақ уақыт бойы фиксаторда жасушаларды қалдырмаңыз, өйткені шамадан тыс бекіту автофлуоресценцияның жоғарылауына және сигнал сапасының төмендеуіне әкелуі мүмкін.
Ағын цитометриясында оңтайлы бекітуге арналған кеңестер
Шамадан тыс бекітуді болдырмау
Жасушалар тым ұзақ уақыт бойы фиксаторға әсер еткенде шамадан тыс фиксация орын алады, бұл жасушалық ақуыздардың шамадан тыс айқаспалы байланысына және деректердің сапасына нұқсан келтіруі мүмкін. Бұл автофлуоресценцияға, антиденелердің байланысуының төмендеуіне және ағын цитометриясының дұрыс емес өлшемдеріне әкелуі мүмкін. Шамадан тыс фиксацияны болдырмау үшін әрқашан нақты ұяшық түріне және тәжірибеге ұсынылған бекіту уақыттарын тексеріңіз.
Бекіту уақыты және үлгі түрі
Оңтайлы бекіту уақыты жасуша түріне және тәжірибенің сипатына байланысты өзгеруі мүмкін. Мысалы, иммундық жасушалар тін үлгілеріне қарағанда қысқа бекіту уақытын қажет етуі мүмкін. Үлгі түрінің ерекше қажеттіліктеріне негізделген бекіту уақытын реттеңіз. Беттік ақуызды талдау үшін әдетте қысқарақ бекіту уақыты (10-15 минут) жеткілікті. Жасушаішілік бояу немесе ДНҚ талдауы үшін ұзағырақ фиксация уақыты қажет болуы мүмкін.
Бекітуден кейінгі бояу
Жасушаларды бекіткеннен кейін антиденелермен немесе флуоресцентті бояғыштармен бояу ағынды цитометриялық талдаудың маңызды қадамы болып табылады. Кейбір флуоресцентті бояғыштар, әсіресе тандемдік бояғыштар, бекітуге сезімтал болуы мүмкін және жасушалар шамадан тыс бекітілген болса, нашарлауы мүмкін. Оңтайлы бояу нәтижелері үшін, мүмкіндігінше, фиксациядан бұрын жасушаларды бояу ұсынылады. Бұл бояудың деградациясын болдырмауға және күшті флуоресценция сигналдарын қамтамасыз етуге көмектеседі.
Ағындық цитометрия үшін бекітілген ұяшықтарды сақтау
Қысқа мерзімді сақтау
Қысқа мерзімді сақтау үшін бекітілген ұяшықтарды тоңазытқышта 2-8°С температурада сақтауға болады. Бұл бекітуден кейін бір-екі күн ішінде жасушаларды талдауды жоспарлағанда өте қолайлы. Флуоресцентті сигналдарға әсер етуі мүмкін фотоағартуды болдырмау үшін бекітілген ұяшықтарды әрқашан қараңғы жерде сақтаңыз.
Ұзақ мерзімді сақтау
Ұзақ мерзімді сақтау үшін жасушаларды криоконсервациялау орталарында мұздатуға болады. Әдеттегі криоконсервациялау ортасы 10% диметилсульфоксидтен (DMSO) және 90% ұрықтың ірі қара сарысуынан (FBS) тұрады. Дегенмен, mFreSR™ немесе CryoStor™ CS10 сияқты сарысусыз криоконсервациялау шешімдері де қол жетімді және оларды FBS-ке қатысты мәселелерді болдырмау үшін пайдалануға болады. Мұз кристалының пайда болуын болдырмау үшін жасушаларды мұздату үшін бақыланатын жылдамдықты мұздатқышты пайдаланыңыз. Бұл жасушаның өміршеңдігін сақтауға көмектеседі және дұрыс сақтауды қамтамасыз етеді.
Ағындық цитометрия үшін жасушаны бекіту кезінде болдырмауға болатын жалпы қателіктер
Дұрыс емес бекітудің әсері
Дұрыс емес бекіту бірнеше мәселелерге әкелуі мүмкін, соның ішінде автофлуоресценция, антиденелердің байланысуының төмендеуі және жасушаның нашар өміршеңдігі. Бұл мәселелер ағын цитометриясы нәтижелерінің дәлдігі мен сенімділігіне айтарлықтай әсер етуі мүмкін. Әрқашан нақты үлгі түріне арналған бекіту хаттамаларын тексеріңіз және бекіту шарттары талданатын ұяшық түріне және маркерлерге сәйкес келетініне көз жеткізіңіз.
Қолданбаңыз үшін дұрыс фиксаторды таңдау
Ағындық цитометрия тәжірибесі үшін сәйкес фиксаторды таңдау сенімді және дәл нәтижелерді алу үшін өте маңызды. Әртүрлі бекіткіштер әртүрлі қолданбалар үшін жақсырақ. Мысалы, PFA әдетте беткі ақуызды талдау үшін пайдаланылады, ал этанол ДНҚ негізіндегі зерттеулер үшін өте қолайлы. Экспериментті бастамас бұрын арнайы қолданбаңыз үшін ең жақсы фиксаторды зерттеп, бекіту протоколын сәйкесінше реттеңіз.
Қорытынды
Ағынды цитометриялық талдауды сәтті өткізу үшін жасушаны дұрыс бекіту маңызды. Ол жасушалық құрылымдарды сақтауға көмектеседі және ақуыздар мен ДНҚ тұтастығын қамтамасыз етеді. Тиісті бекіту хаттамаларын орындау және артық бекітуді болдырмау арқылы зерттеушілер деректердің дәлдігі мен сенімділігін арттыра алады. Экспериментке сәйкес фиксаторды таңдау нәтижелердің жалпы сапасын жақсартады. Осы ең жақсы тәжірибелерді енгізу ағынның цитометриялық талдауы ұялы функциялар туралы дәйекті, қайталанатын түсініктерді қамтамасыз етеді.
Ағын цитометриясында жасушаны дұрыс бекіту маңызды рөл атқарады және одан алынған өнімдер HKeybio сенімді шешімдер ұсынады. Олардың ұсыныстары жоғары сапалы нәтижелерді қамтамасыз етеді және бүкіл әлем бойынша зерттеушілер жасушаны дәл талдау үшін сенім артады.
Жиі қойылатын сұрақтар
С: Ағын цитометриясында жасушаны бекітудің маңызы қандай?
A: Жасуша фиксациясы ағын цитометриясында өте маңызды, өйткені ол жасушалық құрылымдарды сақтайды және дәл талдау үшін ақуыздар мен ДНҚ тұтастығын қамтамасыз етеді.
С: Ағынды цитометрия үшін жасушаларды қанша уақытқа бекіту керек?
A: Жасуша тұтастығын сақтау үшін әдетте жасушаларды 2-4% параформальдегид (PFA) ерітіндісімен 15-30 минут бойы бекіту керек.
С: Ағын цитометриясында жасушаны бекіту үшін этанолды қолдануға бола ма?
Ж: Иә, этанолды бекіту әдетте ағын цитометриясында ДНҚ мазмұнын талдау үшін, әсіресе жасушалық циклді зерттеу үшін қолданылады.
С: Ағындық цитометрияда жасушалар шамадан тыс бекітілсе не болады?
A: Шамадан тыс фиксация ағынды цитометрия нәтижелеріне әсер етуі мүмкін автофлуоресценцияға және нашар антиденелердің байланысуына әкелетін шамадан тыс айқаспалы байланысты тудыруы мүмкін.
