Кіріспе
Сіз қалай ойладыңыз ба? Ағын цитометриясы осындай дәл және сенімді ұяшықтарды талдауға қол жеткізеді? Дәл нәтижелердің кілті ұяшықтың дұрыс бекітілуінде жатыр. Ағын цитометриясы зерттеушілерге әр түрлі жасушалық сипаттамаларды, өлшемнен флуоресценцияның қарқындылығына дейін оқуға мүмкіндік береді. Дегенмен, дұрыс бекітілместен, деректер шынайы жасушалық қасиеттерді көрсетпеуі мүмкін. Бұл мақалада біз ағынды цитометрияда жасушаны бекітудің маңыздылығын зерттейміз, әртүрлі бекіту әдістерін талқылаймыз және оңтайлы нәтижелерге қатысты кеңестермен бөлісеміз.
Ағынды цитометрияда жасушаны бекіту дегеніміз не?
Жасушаны бекіту анықтамасы
Ұяшықты бекіту - бұл олардың құрылымындағы, жұмысының және молекулалық құрамның өзгеруіне жол бермеу арқылы жасушаларды тұрақтандырады және сақтайды. Бұл процеске химиялық жолмен байланыстыратын ақуыздар, липидтер және басқа жасушалық компоненттер, тиімді «мұздату » ағымдағы күйдегі жасушалармен қол жеткізіледі. Бұл әсіресе ағынды цитометрияда өте маңызды, өйткені ол жасушалық маркерлердің тозуын немесе талдау кезінде жасушалық құрылымдардың өзгеруіне жол бермейді. Жасушаларды бекіту арқылы зерттеушілер жасушалардың сипаттамалары дәйекті болып қалуын қамтамасыз ете алады, бұл ағынды цитометрияны талдау кезінде дәл өлшеуге және сенімді мәліметтерді алуға мүмкіндік береді.
Неліктен бекіту маңызды
Дұрыс бекіту өте маңызды, өйткені ол жасушалық ақуыздар мен нуклеин қышқылдарының тұтастығын сақтайды, бұл велометрияның дәл ағынын талдау үшін өте маңызды. Егер ұяшықтар түзетілмесе, олардың құрылымы мен молекулалық маркерлері уақыт өте келе нашарлай немесе өзгеруі мүмкін, олар дұрыс емес және дұрыс емес нәтижеге әкелуі мүмкін. Бекіту сонымен қатар, сонымен қатар, көп параметрлік талдау үшін жасушаларда тұрақтандыруда, бұл ағынның цитометриясының негізгі күшті жақтарының бірі болып табылады. Бұл зерттеушілерге бір уақытта жер бетіндегі маркерлер, жасушаішілік ақуыздар және ДНҚ мазмұны сияқты бірнеше жасуша мүмкіндіктерін бағалауға мүмкіндік береді. Дұрыс бекітілмеген, алынған мәліметтер сәйкес келмейтін немесе толық емес болуы мүмкін, бұл тәжірибелік нәтижелердің дұрыс түсінілмеуі мүмкін.
Ағын цитометриясының бекіту әдістерінің түрлері
Параформальдегид (PFA) бекіту
ParaForamaldehyde (PFA) - бұл ағынды цитометриядағы ең көп қолданылатын фикмамандардың бірі, ең алдымен, оның жасуша морфологиясы мен антигендікті сақтаудың тиімділігіне байланысты. Ол ұяшықтардағы ақуыздар арқылы жұмыс істейді, ұялы құрылымның да, беткі ақуыздарының екеуі де сақталуын қамтамасыз етеді. Бұл PFA жасушалық борыштарды сақтау үшін тамаша таңдау жасайды, әсіресе иммунофенотиптік тәжірибелерде беттік ақуыздың өрнегін талдау кезінде.
Ұсыныс:
● Концентрация: PFA 2-4% оңтайлы бекіту үшін қолданылады.
● Бекіту уақыты: Ұяшықтарды PFA-да 2-8 ° C температурада 15-30 минут инкубациялау керек.
Сақтау: бекітілгеннен кейін ұяшықтар қысқа мерзімді сақтау үшін 2-8 ° C температурада сақталуы керек. Бекітілген ұяшықтарды ұзақ уақыт сақтамау өте маңызды, өйткені бұл маркердің тұтастығының жоғалуына әкелуі мүмкін.
Артық жөндеуден аулақ болу керек, өйткені PFA-ға ұзақ уақыт әсер ету жасушалық аутофлуоресценцияға әкелуі мүмкін және кейінгі бояу мен талдауға кедергі келтіруі мүмкін. Әрқашан бекітілген уақыттың минималды мөлшерін қолданыңыз.
Этанолды бекіту
Этанолды бекіту көбінесе анализдің фокусы, мысалы, жасуша циклындағы зерттеулерде болған кезде қолданылады. Этанол - бұл жасуша мембранасына еніп, жасушалардағы ДНҚ-ны сақтау арқылы жұмыс істейтін құрғатқыш агент. Бұл этанолды бекітуді әсіресе ДНҚ-ға негізделген талдаулар мен ағынды цитометрия үшін пайдалы етеді, онда жасуша циклы кезеңдері немесе ДНҚ мазмұны тексеріледі.
Ұсыныс:
● Концентрация: әдетте, 70-100% этанол қолданылады.
● Бекіту уақыты: этанолды бекіту әдетте оңтайлы нәтижелерге 10-15 минут қажет.
Этанолды бекіту жасуша циклын сақтауға өте ыңғайлы, оны жасуша циклын талдау үшін DNA байланыстырушы бояғыштармен бірге қолдануға болады.
Метанолды бекіту
Метанол - бұл жиі қолданылатын тағы бір фикативті, әсіресе жасушаішілік талдаулар үшін. Ол жасуша мембранасына еніп, жасушаның ішкі құрылымдарын тұрақтандыру арқылы жұмыс істейді. Метанол жасушалық ақуыздар мен антигендерді сақтауда тиімді болғанымен, ол жасуша шөгуіне әкелуі мүмкін, бұл жасушаның мөлшері мен морфологиясы сияқты белгілі бір белгілерді түсіндіруге әсер етуі мүмкін.
Ұсыныс:
● Концентрация: әдетте, 90-100% метанол қолданылады.
● Бекіту уақыты: 10-15 минут әдетте жеткілікті.
Метанолды бекіту жасушаішілік ақуыздарды, әсіресе цитоплазма немесе ядро ішіндегі маркерлерді тексерген кезде жиі жұмыс істейді. Алайда, зерттеушілер метанолды бекіту кезінде жасуша шөгінділерінің әлеуетін ескеруі керек.
Басқа фикмамдар (мысалы, формалин)
Формалин, судағы формальдегидті шешу, бұл ағынның цитометриясында қолданылатын тағы бір фиксативті, бірақ ол PFA-ға қарағанда аз. Формалин гистологияда және иммуногистохимияда кеңінен қолданылады, онда ол микроскопиялық талдау үшін тіндердің үлгілерін тиімді сақтайды. Формалин жасуша конструкцияларын сақтай алса да, егер ол бекітілген тіндердің үлгілерімен жұмыс жасамаса, ағынды цитометрия үшін ұсынылмайды, өйткені ол ұяшықтардың сұрыпталуына және флуоресцесценцияға кедергі келтіруі мүмкін. Формалинді бекіту жеке жасушалар үшін емес, тіндердің үлгілеріне қолайлы.
Бекіту |
Шоғырлау |
Бекіту уақыты |
Ұсынылатын пайдалану |
ParaForamaldehyde (PFA) |
2-4% |
15-30 минут |
Жасуша бетінің маркерлерін сақтауға өте ыңғайлы; Иммунофенотипке ортақ |
Этанап |
70-100% |
10-15 минут |
ДНҚ мазмұнын талдау және жасуша циклын зерттеу үшін жақсы |
Метанол |
90-100% |
10-15 минут |
Жасушаішілік ақуызды талдауға жарамды; Ұяшық шөгінділеріне әкелуі мүмкін |
Формалин |
10% (формальдегид) |
Әр түрлі (матаға байланысты) |
Әдетте жеке жасушалар үшін емес, бекітілген тіндердің үлгілері үшін қолданылады |
Ағын цитометриясына арналған жасушаларды бекіту үшін қадамдық нұсқаулық
Ұяшық үлгісін дайындау
Бекітілгенге дейін жасушаларды тіндерден немесе қан үлгісінен оқшаулау қажет. Центрифугалау - бұл суспензияда жасушаларды шоғырландыру үшін қолданылатын ең көп таралған әдіс. Сондай-ақ, егер түзету процесіне кедергі келтіруі мүмкін кез-келген мәдениетті және қалдық ластаушы заттарды кетіру үшін жасушаларды мұқият жуу өте маңызды.
1.. Ұяшықты оқшаулау: центрифугалау немесе жасуша сұрыптау сияқты стандартты оқшаулау әдістерін қолданыңыз, мысалы, центрифугация немесе жасушалық сұрыптау.
2
Бекіту тәртібі
Ұяшықтар дайындалғаннан кейін, келесі қадам - бұлшықатураны ұяшық суспензиясына қосу. Жуу цитометриясының ең көп қолданылатын фиксикасы - бұл 2-4% PFA шешімі.
1. Ұяшық суспензиясына бекітуді қосыңыз, оны жақсы араластырыңыз.
2. Жасушаларды 2-8 ° C температурада 15-30 минут ішінде инкубациялаңыз.
3
Бекітуден кейінгі қадамдар
Бекітілгеннен кейін жасушаларды мұқият қарау керек. Егер қосымша талдау қажет болса, анализге дейін ұяшықтарды бояу керек. Егер сіз жасушаларды болашақта талдау үшін сақтауды жоспарласаңыз, оларды тиісті буферге қайта жіберіп, оларды 2-8 ° C-тан сақтаңыз. Ұяшықтарды ұзақ уақытқа қалдырудан аулақ болыңыз, өйткені артық бекіту аутофлуоресценцияға және сигналдың төмендеуіне әкелуі мүмкін.
Ағын цитометриясындағы оңтайлы бекіту туралы кеңестер
Артық жөндеуден аулақ болу
Жасушалар тым ұзақ уақытқа созылған кезде, бұл ұялы ақуыздарды шамадан тыс байланыстыруға және деректердің сапасына нұқсан келтіруі мүмкін болған кезде пайда болады. Бұл аутофлуоресценцияға, антидене байланысы мен антидене байланысы төмендейтін және дұрыс емес ағын-цитометрия өлшеулеріне әкелуі мүмкін.
Бекіту уақыты VS. Үлгі түрі
Оңтайлы бекіту уақыты жасуша түріне және эксперименттің сипатына байланысты өзгеруі мүмкін. Мысалы, иммундық жасушалар тіндердің үлгілеріне қарағанда қысқарту уақытын қажет етуі мүмкін. Үлгі түрінің нақты қажеттіліктеріне негізделген бекіту уақытын реттеңіз. Ақуызды талдау үшін қысқа бекіту уақыты (10-15 минут) әдетте жеткілікті. Жасушаішілік бояу немесе ДНҚ талдауы үшін ұзағырақ бекіту уақыты қажет болуы мүмкін.
Бекітілгеннен кейін бояу
Жасушаларды бекіткеннен кейін антиденелермен немесе люминесцентті бояғыштармен бояу - бұл ағын цитометриясын талдаудағы маңызды қадам. Кейбір флуоресцентті бояғыштар, әсіресе тандем дайдары, егер анемдік бояуларға сезімтал болса және егер ұяшықтар аяқталған болса, төмендетуі мүмкін. Оңтайлы бояу нәтижелері үшін ұяшықтарды мүмкіндігінше бекіту ұсынылады. Бұл бояудың деградациясын болдырмауға және флуоресценцияның күшті болуына көмектеседі.
Ағын цитометриясына арналған бекітілген ұяшықтарды сақтау
Қысқа мерзімді сақтау
Қысқа мерзімді сақтау үшін бекітілген жасушаларды тоңазытқышта 2-8 ° C температурада сақтауға болады. Бұл сіз жасушаларды бір-екі рет, бекітуден кейін талдауды жоспарлаған кезде өте ыңғайлы. Флуоресценттік сигналдарға әсер етуі мүмкін, фотобляктардың алдын алу үшін әрдайым қараңғы жерде сақтаңыз.
Ұзақ мерзімді сақтау
Ұзақ мерзімді сақтау үшін жасушаларды криопрозсерсияда қатып қалуы мүмкін. Криптік криопрессерлік орта 10% диметил сульфоксидінен (DMSO) және 90% ұрық үкі сарысуынан тұрады (FBS). Алайда, Serums Free Cropressert-ті MfResr ™ немесе CryroStor ™ CS10 сияқты ерітінділерге қол жетімді және FBS-мен байланысты мәселелерді болдырмау үшін қолдануға болады. Мұз кристаллының пайда болуын болдырмау үшін қолдануға болады. Бұл жасушаның өміршеңдігін сақтауға көмектеседі және дұрыс сақтауды қамтамасыз етеді.
Ағын цитометриясының жасушаларын бекітуден аулақ болу үшін ортақ бұзушылар
Дұрыс емес бекітудің әсері
Дұрыс емес бекіту бірнеше проблемаларға, соның ішінде автопарлуоресценцияға, антидене байланыстырылған және жасушалардың нашарлауына әкелуі мүмкін. Бұл мәселелер ағынды цитометрия нәтижелерінің дәлдігі мен сенімділігіне айтарлықтай әсер етуі мүмкін. Әрқашан нақты үлгі түріне арналған бекіту протоколдарын тексеріп, құрылғылардың ұяшықтар түрі мен маркерлеріне талданғанына көз жеткізіңіз.
Өтініш үшін дұрыс фиктивті таңдау
Сіздің ағымды цитометрия экспериментінің тиісті фиксативті таңдау сенімді және нақты нәтиже алу үшін өте маңызды. Әр түрлі фиксивтер әртүрлі қосымшаларға сәйкес келеді. Мысалы, PFA беттік ақуызды талдау үшін жиі қолданылады, ал Этанол ДНҚ-ға негізделген зерттеулер үшін өте ыңғайлы. Тәжірибені бастамас бұрын, нақты қосымшаның ең жақсы түзетілуін зерттеп, түзету протоколын сәйкесінше реттеңіз.
Қорытынды
Жасушаның дұрыс бекітілуі цитометрияның сәтті сәтті талдауы үшін қажет. Бұл жасушалық құрылымдарды сақтауға және ақуыздар мен ДНҚ тұтастығын қамтамасыз етеді. Тиісті бекіту хаттамалары бойынша және артық жөндеуден аулақ болу арқылы зерттеушілер деректердің дәлдігі мен сенімділігін арттыра алады. Тәжірибе үшін сәйкес фиктивті таңдау нәтижелеріңіздің жалпы сапасын жақсартады. Осы ең жақсы тәжірибелерді енгізу сіздің ағыныңыздың цитометриясын талдау жасушалық функцияларға дәйекті, репродуктивті түсініктерді қамтамасыз етуді қамтамасыз етеді.
Жасушаның дұрыс бекітілуі ағын цитометриямасында және өнімдерде негізгі рөл атқарады HKEYBIO сенімді шешімдерді ұсынады. Олардың ұсыныстары жоғары сапалы нәтижелерді қамтамасыз етеді және бүкіл әлем бойынша зерттеушілердің жасушалық талдау үшін сенеді.
Жиі қойылатын сұрақтар
С: ағынды цитометрияда жасушаны бекітудің маңыздылығы қандай?
Ж: Жасушаны бекіту ағынды цитометрияда өте маңызды, себебі ол жасушалық құрылымдарды сақтайды және дәл талдау үшін ақуыздар мен ДНҚ-ның тұтастығын қамтамасыз етеді.
С: Жасушалар ағынды цитометрия үшін қанша уақытқа бекітілуі керек?
Ж: Жасушалар, әдетте, жасушалық тұтастыққа ие болу үшін 2-4% параформальдегид (PFA) шешімімен 15-30 минут болуы керек.
С: Мен ағынды цитометрияда жасушаны бекіту үшін этанолды қолдана аламын ба?
Ж: Иә, этанолды бекіту, әсіресе ағынды цитометриядағы ДНҚ мазмұнын талдау үшін қолданылады, әсіресе жасуша циклы үшін қолданылады.
С: Егер жасушалар ағынды цитометрияда шамадан тыс болса, не болады?
Ж: Артық бекіту шамадан тыс байланыстыруды тудыруы мүмкін, бұл аутоциацияға әкелуі мүмкін, бұл ағын цитометриясының нәтижелеріне әсер етуі мүмкін антидене байланысы нашар.
