כיצד לתקן תאים עבור ציטומטריית זרימה

מָבוֹא

האם אי פעם תהיתם איך ציטומטריית זרימה משיגה ניתוח תאים מדויק ואמין כל כך? המפתח לתוצאות מדויקות טמון בקיבוע תאים נכון. ציטומטריית זרימה מאפשרת לחוקרים לחקור מגוון מאפיינים תאיים, מגודל ועד עוצמת הקרינה. עם זאת, ללא קיבוע מתאים, ייתכן שהנתונים לא ישקפו מאפיינים סלולריים אמיתיים. במאמר זה, נחקור את החשיבות של קיבוע תאים בציטומטריית זרימה, נדון בשיטות קיבוע שונות ונחלוק טיפים לתוצאות מיטביות.

 

מהו קיבוע תאים בציטומטריית זרימה?

הגדרה של קיבוע תאים

קיבוע תאים הוא תהליך המייצב ומשמר את התאים על ידי מניעת שינויים במבנה, בתפקוד ובהרכב המולקולרי שלהם. תהליך זה מושג על ידי חיבור כימי של חלבונים, שומנים ורכיבים תאיים אחרים, וביעילות 'הקפאה' של התאים במצבם הנוכחי. זה חשוב במיוחד ב-flow cytometry מכיוון שהוא מונע את השפלה של סמנים תאיים או שינוי של מבנים תאיים במהלך הניתוח. על ידי קיבוע התאים, החוקרים יכולים להבטיח שהמאפיינים של התאים יישארו עקביים, מה שמאפשר מדידות מדויקות ונתונים אמינים במהלך ניתוח ציטומטריית זרימה.

מדוע קיבוע חשוב

קיבוע נכון חיוני מכיוון שהוא שומר על שלמות החלבונים התאיים וחומצות הגרעין, שהן חיוניות לניתוח ציטומטריית זרימה מדויקת. אם התאים אינם מקובעים, המבנה והסממנים המולקולריים שלהם עלולים להתקלקל או להשתנות לאורך זמן, מה שיוביל לתוצאות לא אמינות ולא מדויקות. קיבוע גם ממלא תפקיד קריטי בייצוב תאים לניתוח רב פרמטרים, שהוא אחד מנקודות החוזק המרכזיות של ציטומטריית זרימה. זה מאפשר לחוקרים להעריך בו-זמנית תכונות תאים מרובות, כגון סמני משטח, חלבונים תוך-תאיים ותכולת DNA, בניסוי יחיד. ללא קיבוע מתאים, הנתונים שהתקבלו עלולים להיות לא עקביים או לא שלמים, מה שיוביל לפירוש שגוי של תוצאות הניסוי.

 

סוגי שיטות קיבוע לציטומטריית זרימה

קיבוע פרפורמלדהיד (PFA).

פרפורמלדהיד (PFA) הוא אחד מהחומרים הנפוצים ביותר בשימוש ב-flow cytometry, בעיקר בשל יעילותו בשימור מורפולוגיה ואנטיגניות של התא. זה פועל על ידי קישור בין חלבונים בתוך התאים, ומבטיח שגם המבנה התא וגם חלבוני פני השטח נשארים שלמים. זה הופך את PFA לבחירה מצוינת לשימור סמני פני תאים, במיוחד בעת ניתוח ביטוי חלבון פני השטח בניסויים אימונופנוטיפינג.

הַמלָצָה:

● ריכוז: 2-4% PFA משמש בדרך כלל לקיבוע מיטבי.

● זמן קיבוע: יש להדגיר תאים ב-PFA למשך 15-30 דקות ב-2-8 מעלות צלזיוס.

● אחסון: לאחר הקיבוע, יש לאחסן את התאים ב-2-8 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח קצר. חשוב לא לאחסן תאים קבועים לתקופות ממושכות, מכיוון שהדבר עלול להוביל לאובדן שלמות הסמן.

חשוב להימנע מקיבוע יתר, מכיוון שחשיפה ממושכת ל-PFA עלולה להוביל לאוטופלואורסצנטי תאית ולהפריע לצביעה ולניתוח שלאחר מכן. השתמש תמיד בפרק הזמן המינימלי הנדרש לקיבוע.

קיבוע אתנול

קיבוע אתנול משמש בדרך כלל כאשר המוקד של הניתוח הוא על תוכן DNA, כגון במחקרי מחזור תאים. אתנול הוא חומר מייבש הפועל על ידי חדירת קרום התא ושימור ה-DNA בתוך התאים. זה הופך את קיבוע אתנול לשימושי במיוחד עבור מבחני DNA וניתוחי ציטומטריית זרימה שבהם נבחנים שלבי מחזור התא או תכולת ה-DNA.

הַמלָצָה:

● ריכוז: בדרך כלל, נעשה שימוש ב-70-100% אתנול.

● זמן קיבוע: קיבוע אתנול דורש בדרך כלל 10-15 דקות לתוצאות מיטביות.

קיבוע אתנול הוא אידיאלי לשימור שלבי מחזור התא, וניתן להשתמש בו בשילוב עם צבעים קושרי DNA כגון פרופידיום יודיד (PI) לניתוח מחזור התא.

קיבוע מתנול

מתנול הוא עוד מקבע נפוץ, במיוחד עבור ניתוחים תוך תאיים. זה פועל על ידי חדירת קרום התא וייצוב המבנים הפנימיים של התא. בעוד שמתנול יעיל בשימור חלבונים ואנטיגנים תאיים, הוא יכול לגרום להתכווצות תאים, מה שעלול להשפיע על הפרשנות של תכונות מסוימות, כגון גודל התא ומורפולוגיה.

הַמלָצָה:

● ריכוז: בדרך כלל, נעשה שימוש ב-90-100% מתנול.

● זמן קיבוע: 10-15 דקות בדרך כלל מספיקים.

קיבוע מתנול משמש לעתים קרובות בעת לימוד חלבונים תוך תאיים, במיוחד כאשר בודקים סמנים בתוך הציטופלזמה או הגרעין. עם זאת, החוקרים צריכים לשקול את הפוטנציאל להתכווצות תאים בעת שימוש בקיבוע מתנול.

מקבעים אחרים (למשל, פורמלין)

פורמלין, תמיסה של פורמלדהיד במים, הוא מקבע נוסף המשמש בציטומטריית זרימה, אם כי הוא פחות נפוץ מ-PFA. פורמלין נמצא בשימוש נרחב בהיסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה, שם הוא משמר ביעילות דגימות רקמה לניתוח מיקרוסקופי. למרות שפורמלין יכול לשמר מבני תאים, זה בדרך כלל לא מומלץ לציטומטריית זרימה אלא אם כן עבודה עם דגימות רקמה קבועות, מכיוון שהוא יכול להפריע למיון תאים ולכמה יישומי פלואורסצנטי. קיבוע פורמלין מתאים ביותר לדגימות רקמה, לא לתאים בודדים.

 

מְיַצֵב	ריכוז	זמן קיבוע	שימוש מומלץ
פרפורמלדהיד (PFA)	2-4%	15-30 דקות	אידיאלי לשימור סמני פני התאים; נפוץ עבור אימונופנוטייפ
אתנול	70-100%	10-15 דקות	הטוב ביותר עבור ניתוח תוכן DNA ומחקרי מחזור תאים
מתנול	90-100%	10-15 דקות	מתאים לניתוח חלבון תוך תאי; עלול לגרום להתכווצות התאים
פורמלין	10% (פורמלדהיד)	משתנה (תלוי ברקמה)	משמש בדרך כלל עבור דגימות רקמה קבועות, לא עבור תאים בודדים

 

מדריך שלב אחר שלב לתיקון תאים לציטומטריית זרימה

הכנת דגימת התא

לפני הקיבוע, חיוני לבודד את התאים מהרקמה או מדגימת הדם. צנטריפוגה היא השיטה הנפוצה ביותר המשמשת לריכוז תאים בתרחיף. זה גם קריטי לשטוף את התאים ביסודיות כדי להסיר כל אמצעי תרבות או מזהמים שיוריים, שעלולים להפריע לתהליך הקיבוע.

 

1. בידוד תאים: השתמש בשיטות בידוד סטנדרטיות כגון צנטריפוגה או מיון תאים כדי להפריד בין התאים המעניינים.

2. כביסה: לשטוף את התאים עם מלח פוספט-buffered (PBS) כדי להסיר שאריות מדיה ומזהמים שעלולים להשפיע על תהליך הקיבוע.

הליך קיבוע

לאחר הכנת התאים, השלב הבא הוא להוסיף את המקבע לתרחיף התא. המקבע הנפוץ ביותר עבור ציטומטריית זרימה הוא תמיסת 2-4% PFA.

1. הוסף את המקבע לתרחיף התא, וודא שהוא מעורבב היטב.

2. דגירה על התאים עם המקבע למשך 15-30 דקות ב-2-8 מעלות צלזיוס.

3. לאחר הדגירה, שטפו את התאים פעמיים עם PBS כדי להסיר עודף מקבע.

שלבים לאחר הקיבוע

לאחר הקיבוע, יש לטפל בתאים בזהירות. אם יש צורך בניתוח נוסף, יש לצבוע את התאים לפני הניתוח. אם אתה מתכנן לאחסן את התאים לניתוח עתידי, השהה אותם מחדש במאגר מתאים ואחסן אותם ב-2-8 מעלות צלזיוס. הימנע מהשארת תאים במקבע לתקופות ארוכות, מכיוון שקיבוע יתר עלול להוביל להגברת אוטופלואורסצנטי ואיכות האות מופחתת.

 

טיפים לקיבוע אופטימלי בציטומטריית זרימה

הימנעות מקיבוע יתר

קיבוע יתר מתרחש כאשר תאים נחשפים למקבע זמן רב מדי, מה שעלול לגרום לקישור מוגזם של חלבונים תאיים ולפגוע באיכות הנתונים. זה יכול להוביל ל-autofluorescence, קשירת נוגדנים מופחתת ומדידות ציטומטריית זרימה לא מדויקות. בדוק תמיד את זמני הקיבוע המומלצים עבור סוג התא והניסוי הספציפיים שלך כדי למנוע קיבוע יתר.

זמן קיבוע לעומת סוג מדגם

זמן הקיבוע האופטימלי עשוי להשתנות בהתאם לסוג התא ואופי הניסוי. לדוגמה, תאי חיסון עשויים לדרוש זמני קיבוע קצרים יותר מאשר דגימות רקמה. התאם את זמן הקיבוע בהתאם לצרכים הספציפיים של סוג המדגם. עבור ניתוח חלבון משטח, זמן קיבוע קצר יותר (10-15 דקות) בדרך כלל מספיק. עבור צביעה תוך תאית או ניתוח DNA, ייתכן שיידרש זמן קיבוע ארוך יותר.

מכתים לאחר קיבוע

לאחר תיקון התאים, צביעה בנוגדנים או בצבעי פלורסנט היא שלב קריטי בניתוח ציטומטריית זרימה. כמה צבעים פלורסנטים, במיוחד צבעי טנדם, יכולים להיות רגישים לקיבוע ועלולים להתקלקל אם התאים מקובעים יתר על המידה. לקבלת תוצאות צביעה אופטימליות, מומלץ לצבוע את התאים לפני הקיבוע במידת האפשר. זה יכול לעזור למנוע פירוק צבע ולהבטיח אותות פלואורסצנטי חזקים יותר.

 

אחסון תאים קבועים לציטומטריית זרימה

אחסון לטווח קצר

לאחסון לטווח קצר, ניתן לאחסן תאים קבועים במקרר בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס. זה אידיאלי כאשר אתה מתכנן לנתח את התאים בתוך יום או יומיים לאחר הקיבוע. אחסן תמיד תאים קבועים בחושך כדי למנוע הלבנת צילום, שעלולה להשפיע על האותות הפלורסנטים.

אחסון לטווח ארוך

לאחסון לטווח ארוך, ניתן להקפיא תאים במדיית שימור הקפאה. מצע טיפוסי להקפאה מורכב מ-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ו-90% סרום בקר עוברי (FBS). עם זאת, פתרונות שימור הקפאה ללא סרום כמו mFreSR™ או CryoStor™ CS10 זמינים גם וניתן להשתמש בהם כדי למנוע בעיות הקשורות ל-FBS. כדי למנוע היווצרות גבישי קרח, השתמש במקפיא בקצב מבוקר כדי להקפיא את התאים. זה עוזר לשמור על כדאיות התא ומבטיח אחסון נאות.

 

מלכודות נפוצות שיש להימנע מהן בקיבוע תאים עבור ציטומטריית זרימה

השפעות של קיבוע לא תקין

קיבוע לא תקין יכול להוביל למספר בעיות, כולל אוטופלואורסצנטי, הפחתת קשירת נוגדנים וחיות תאים לקויה. בעיות אלו יכולות להשפיע באופן משמעותי על הדיוק והאמינות של תוצאות ציטומטריית זרימה. אמת תמיד את פרוטוקולי הקיבוע עבור סוג המדגם הספציפי שלך, וודא שתנאי הקיבוע מתאימים לסוג התא ולסמנים המנותחים.

בחירת המתקן המתאים ליישום שלך

בחירת המקבע המתאים לניסוי הציטומטריה של הזרימה שלך היא חיונית להשגת תוצאות אמינות ומדויקות. מקבעים שונים מתאימים יותר ליישומים שונים. לדוגמה, PFA משמש בדרך כלל עבור ניתוח חלבון פני השטח, בעוד אתנול הוא אידיאלי עבור מחקרים מבוססי DNA. לפני תחילת הניסוי, חקר את המקבע הטוב ביותר עבור היישום הספציפי שלך והתאם את פרוטוקול הקיבוע בהתאם.

 

מַסְקָנָה

קיבוע תאי תקין חיוני להשגת ניתוח ציטומטריית זרימה מוצלח. זה עוזר לשמר מבנים תאיים ומבטיח את שלמות החלבונים וה-DNA. על ידי הקפדה על פרוטוקולי קיבוע נאותים והימנעות מקיבוע יתר, החוקרים יכולים לשפר את הדיוק והאמינות של הנתונים. בחירת המקבע המתאים לניסוי שלך משפרת את האיכות הכוללת של התוצאות שלך. יישום שיטות עבודה מומלצות אלה מבטיח שניתוח ציטומטריית הזרימה שלך מספק תובנות עקביות וניתנות לשחזור לגבי פונקציות סלולריות.

 

קיבוע תאי תקין משחק תפקיד מפתח ב-flow cytometry, ומוצרים מ HKeybio מציעים פתרונות אמינים. ההיצע שלהם מבטיח תוצאות באיכות גבוהה והם מהימנים על ידי חוקרים ברחבי העולם לניתוח תאים מדויק.

 

שאלות נפוצות

ש: מהי החשיבות של קיבוע תאים ב-flow cytometry?

ת: קיבוע תאים הוא חיוני ב-flow cytometry שכן הוא משמר מבנים תאיים ומבטיח את שלמות החלבונים וה-DNA לניתוח מדויק.

ש: כמה זמן צריך לתקן תאים לצורך ציטומטריית זרימה?

ת: בדרך כלל יש לקבע את התאים למשך 15-30 דקות עם תמיסה של 2-4% פרפורמלדהיד (PFA) כדי לשמור על שלמות התא.

ש: האם אני יכול להשתמש באתנול לקיבוע תאים ב-flow cytometry?

ת: כן, קיבוע אתנול משמש בדרך כלל לניתוח תכולת DNA בציטומטריית זרימה, במיוחד עבור מחקרי מחזור תאים.

ש: מה קורה אם תאים מקובעים יתר על המידה ב-flow cytometry?

ת: קיבוע יתר עלול לגרום לקישור מוגזם, מה שמוביל לאוטופלואורסצנטי וקשירת נוגדנים לקויה, מה שעלול להשפיע על תוצאות ציטומטריית הזרימה.