Sissejuhatus
Kas olete kunagi mõelnud, kuidas voolutsütomeetria saavutab nii täpse ja usaldusväärse rakuanalüüsi? Täpsete tulemuste võti seisneb rakkude õiges fikseerimises. Voolutsütomeetria võimaldab teadlastel uurida mitmesuguseid raku omadusi, alates suurusest kuni fluorestsentsi intensiivsuseni. Kuid ilma nõuetekohase fikseerimiseta ei pruugi andmed kajastada raku tegelikke omadusi. Selles artiklis uurime rakkude fikseerimise tähtsust voolutsütomeetrias, arutame erinevaid fikseerimismeetodeid ja jagame näpunäiteid optimaalsete tulemuste saavutamiseks.
Mis on rakkude fikseerimine voolutsütomeetrias?
Rakkude fikseerimise määratlus
Rakkude fikseerimine on protsess, mis stabiliseerib ja säilitab rakke, vältides muutusi nende struktuuris, funktsioonis ja molekulaarses koostises. See protsess saavutatakse valkude, lipiidide ja muude rakukomponentide keemilise ristsidumisega, 'külmutades' rakud tõhusalt nende praeguses olekus. See on eriti oluline voolutsütomeetrias, kuna see hoiab ära rakumarkerite lagunemise või rakustruktuuride muutumise analüüsi ajal. Rakkude fikseerimisega saavad teadlased tagada, et rakkude omadused jäävad järjepidevaks, mis võimaldab voolutsütomeetria analüüsi ajal täpseid mõõtmisi ja usaldusväärseid andmeid.
Miks on fikseerimine oluline
Õige fikseerimine on hädavajalik, kuna see säilitab raku valkude ja nukleiinhapete terviklikkuse, mis on täpse voolutsütomeetria analüüsi jaoks üliolulised. Kui rakke ei fikseerita, võivad nende struktuur ja molekulaarsed markerid aja jooksul laguneda või muutuda, mis toob kaasa ebausaldusväärsed ja ebatäpsed tulemused. Fikseerimine mängib kriitilist rolli ka rakkude stabiliseerimisel mitmeparameetrilise analüüsi jaoks, mis on voolutsütomeetria üks peamisi tugevusi. See võimaldab teadlastel hinnata ühe katsega samaaegselt mitut raku tunnust, nagu pinnamarkerid, rakusisesed valgud ja DNA sisaldus. Ilma nõuetekohase fikseerimiseta võivad saadud andmed olla ebajärjekindlad või mittetäielikud, mis võib viia katsetulemuste valesti tõlgendamiseni.
Voolutsütomeetria fikseerimismeetodite tüübid
Paraformaldehüüdi (PFA) fikseerimine
Paraformaldehüüd (PFA) on üks voolutsütomeetrias kõige laialdasemalt kasutatavaid fiksaate, eelkõige tänu oma efektiivsusele raku morfoloogia ja antigeensuse säilitamisel. See toimib valkude ristsidumisel rakkudes, tagades nii raku struktuuri kui ka pinnavalgude puutumatuse. See teeb PFA-st suurepärase valiku rakupinna markerite säilitamiseks, eriti pinnavalgu ekspressiooni analüüsimisel immunofenotüüpimise katsetes.
Soovitus:
● Kontsentratsioon: optimaalseks fikseerimiseks kasutatakse tavaliselt 2–4% PFA-d.
● Fiksatsiooniaeg: rakke tuleks inkubeerida PFA-s 15–30 minutit temperatuuril 2–8 °C.
● Säilitamine: pärast fikseerimist tuleb rakke hoida lühiajaliseks säilitamiseks temperatuuril 2–8°C. Oluline on mitte säilitada fikseeritud rakke pikema aja jooksul, kuna see võib viia markeri terviklikkuse kadumiseni.
Oluline on vältida liigset fikseerimist, kuna pikaajaline kokkupuude PFA-ga võib põhjustada raku autofluorestsentsi ning segada järgnevat värvimist ja analüüsi. Kasutage fikseerimiseks alati minimaalselt vajalikku aega.
Etanooli fikseerimine
Etanooliga fikseerimist kasutatakse tavaliselt siis, kui analüüsi keskmes on DNA sisaldus, näiteks rakutsükli uuringutes. Etanool on veetustav aine, mis tungib läbi rakumembraani ja säilitab rakkudes DNA. See muudab etanooli fikseerimise eriti kasulikuks DNA-põhiste analüüside ja voolutsütomeetria analüüside jaoks, kus uuritakse rakutsükli etappe või DNA sisaldust.
Soovitus:
● Kontsentratsioon: tavaliselt kasutatakse 70–100% etanooli.
● Fikseerimisaeg: Etanooliga fikseerimine nõuab optimaalsete tulemuste saavutamiseks tavaliselt 10–15 minutit.
Etanooliga fikseerimine sobib ideaalselt rakutsükli faaside säilitamiseks ja seda saab rakutsükli analüüsiks kasutada koos DNA-d siduvate värvainetega, nagu propiidiumjodiid (PI).
Metanooli fikseerimine
Metanool on teine tavaliselt kasutatav fiksaator, eriti rakusiseste analüüside jaoks. See toimib, tungides läbi rakumembraani ja stabiliseerides raku sisemisi struktuure. Kuigi metanool säilitab tõhusalt raku valke ja antigeene, võib see põhjustada rakkude kokkutõmbumist, mis võib mõjutada teatud tunnuste, nagu raku suuruse ja morfoloogia, tõlgendamist.
Soovitus:
● Kontsentratsioon: tavaliselt kasutatakse 90–100% metanooli.
● Fikseerimisaeg: tavaliselt piisab 10-15 minutist.
Metanooli fikseerimist kasutatakse sageli intratsellulaarsete valkude uurimisel, eriti tsütoplasmas või tuumas olevate markerite uurimisel. Siiski peaksid teadlased metanooliga fikseerimise kasutamisel arvestama rakkude kokkutõmbumise võimalikkusega.
Muud fikseerivad ained (nt formaliin)
Formaliin, formaldehüüdi lahus vees, on veel üks voolutsütomeetrias kasutatav fiksaator, kuigi see on vähem levinud kui PFA. Formaliini kasutatakse laialdaselt histoloogias ja immunohistokeemias, kus see säilitab tõhusalt koeproove mikroskoopiliseks analüüsiks. Kuigi formaliin võib säilitada rakustruktuure, ei ole see üldiselt soovitatav voolutsütomeetria jaoks, välja arvatud juhul, kui töötatakse fikseeritud koeproovidega, kuna see võib häirida rakkude sorteerimist ja mõningaid fluorestsentsrakendusi. Formaliini fikseerimine sobib kõige paremini koeproovide, mitte üksikute rakkude jaoks.
Fikseeriv |
Keskendumine |
Fikseerimise aeg |
Soovitatav kasutamine |
Paraformaldehüüd (PFA) |
2-4% |
15-30 minutit |
Ideaalne rakupinna markerite säilitamiseks; levinud immunofenotüüpimiseks |
Etanool |
70-100% |
10-15 minutit |
Parim DNA sisu analüüsi ja rakutsükli uuringute jaoks |
metanool |
90-100% |
10-15 minutit |
Sobib intratsellulaarseks valguanalüüsiks; võib põhjustada rakkude kokkutõmbumist |
Formaliini |
10% (formaldehüüd) |
Varieerub (sõltub koest) |
Tavaliselt kasutatakse fikseeritud koeproovide, mitte üksikute rakkude jaoks |
Samm-sammuline juhend rakkude fikseerimiseks voolutsütomeetria jaoks
Rakuproovi ettevalmistamine
Enne fikseerimist on oluline rakud koest või vereproovist eraldada. Tsentrifuugimine on kõige levinum meetod rakkude kontsentreerimiseks suspensioonis. Samuti on kriitilise tähtsusega rakud põhjalikult pesta, et eemaldada kõik söötmed või jääksaasteained, mis võivad fikseerimisprotsessi segada.
1. Rakkude eraldamine: kasutage huvipakkuvate rakkude eraldamiseks standardseid isoleerimismeetodeid, nagu tsentrifuugimine või rakkude sorteerimine.
2. Pesemine: peske rakke fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS), et eemaldada jääkkeskkond ja saasteained, mis võivad fikseerimisprotsessi mõjutada.
Fikseerimisprotseduur
Kui rakud on ette valmistatud, on järgmiseks fiksaatori lisamine rakususpensioonile. Voolutsütomeetria kõige sagedamini kasutatav fiksaator on 2-4% PFA lahus.
1. Lisage rakususpensioonile fikseeriv aine, tagades, et see on hästi segunenud.
2. Inkubeerige rakke fiksaatoriga 15-30 minutit temperatuuril 2-8°C.
3. Pärast inkubeerimist peske rakke kaks korda PBS-ga, et eemaldada liigne fiksaator.
Fikseerimisjärgsed sammud
Pärast fikseerimist tuleb rakke hoolikalt käsitseda. Kui on vaja täiendavat analüüsi, tuleks rakud enne analüüsimist värvida. Kui kavatsete rakke edaspidiseks analüüsiks säilitada, suspendeerige need uuesti sobivas puhvris ja hoidke neid temperatuuril 2–8 °C. Vältige rakkude pikaks ajaks fiksaatorisse jätmist, kuna liigne fikseerimine võib suurendada autofluorestsentsi ja halvendada signaali kvaliteeti.
Näpunäiteid voolutsütomeetria optimaalseks fikseerimiseks
Ülemäärase fikseerimise vältimine
Ülefiksatsioon tekib siis, kui rakud puutuvad fiksaatoriga liiga kaua kokku, mis võib põhjustada rakuvalkude liigset ristsidumist ja kahjustada andmete kvaliteeti. See võib põhjustada autofluorestsentsi, vähenenud antikehade sidumist ja ebatäpseid voolutsütomeetria mõõtmisi. Kontrollige alati oma konkreetse rakutüübi jaoks soovitatud fikseerimisaegu ja katsetage, et vältida ülefikseerumist.
Fikseerimisaeg vs proovi tüüp
Optimaalne fikseerimisaeg võib varieeruda sõltuvalt rakutüübist ja katse olemusest. Näiteks võivad immuunrakud vajada lühemat fikseerimisaega kui koeproovid. Reguleerige fikseerimisaega vastavalt proovitüübi spetsiifilistele vajadustele. Pinnavalgu analüüsiks piisab tavaliselt lühemast fikseerimisajast (10-15 minutit). Intratsellulaarse värvimise või DNA analüüsi jaoks võib olla vajalik pikem fikseerimisaeg.
Värvimine pärast fikseerimist
Pärast rakkude fikseerimist on voolutsütomeetria analüüsis kriitiline samm antikehade või fluorestsentsvärvidega värvimine. Mõned fluorestseeruvad värvid, eriti tandemvärvid, võivad olla fikseerimise suhtes tundlikud ja võivad laguneda, kui rakud on üle fikseeritud. Optimaalsete värvimistulemuste saavutamiseks on soovitatav rakud enne fikseerimist igal võimalusel värvida. See võib aidata vältida värvi lagunemist ja tagada tugevamad fluorestsentssignaalid.
Fikseeritud rakkude salvestamine voolutsütomeetria jaoks
Lühiajaline ladustamine
Lühiajaliseks säilitamiseks võib fikseeritud rakke hoida külmkapis 2-8°C juures. See on ideaalne, kui plaanite rakke analüüsida päeva või kahe jooksul pärast fikseerimist. Hoidke fikseeritud rakke alati pimedas, et vältida fotopleegitamist, mis võib mõjutada fluorestsentssignaale.
Pikaajaline ladustamine
Pikaajaliseks säilitamiseks võib rakke külmutada külmsäilituskeskkonnas. Tüüpiline külmsäilituskeskkond koosneb 10% dimetüülsulfoksiidist (DMSO) ja 90% veiseloote seerumist (FBS). Siiski on saadaval ka seerumivabad külmsäilituslahused, nagu mFreSR™ või CryoStor™ CS10, ja neid saab kasutada FBS-iga seotud probleemide vältimiseks. Jääkristallide moodustumise vältimiseks kasutage rakkude külmutamiseks kontrollitud kiirusega sügavkülmikut. See aitab säilitada rakkude elujõulisust ja tagab õige ladustamise.
Levinud lõksud, mida voolutsütomeetria rakkude fikseerimisel vältida
Ebaõige fikseerimise tagajärjed
Vale fikseerimine võib põhjustada mitmeid probleeme, sealhulgas autofluorestsentsi, vähenenud antikehade sidumist ja rakkude halba elujõulisust. Need probleemid võivad oluliselt mõjutada voolutsütomeetria tulemuste täpsust ja usaldusväärsust. Kontrollige alati oma konkreetse proovitüübi fikseerimisprotokolle ja veenduge, et fikseerimistingimused on analüüsitava rakutüübi ja markerite jaoks sobivad.
Teie rakenduse jaoks sobiva kinnitusvahendi valimine
Voolutsütomeetria katse jaoks sobiva fiksaatori valimine on usaldusväärsete ja täpsete tulemuste saamiseks ülioluline. Erinevate rakenduste jaoks sobivad paremini erinevad fiksaatorid. Näiteks PFA-d kasutatakse tavaliselt pinnavalgu analüüsiks, samas kui etanool on ideaalne DNA-põhiste uuringute jaoks. Enne katse alustamist uurige oma konkreetse rakenduse jaoks parimat fiksaatorit ja kohandage fikseerimisprotokolli vastavalt.
Järeldus
Rakkude õige fikseerimine on eduka voolutsütomeetria analüüsi saavutamiseks hädavajalik. See aitab säilitada rakustruktuure ning tagab valkude ja DNA terviklikkuse. Järgides õigeid fikseerimisprotokolle ja vältides ülefikseerimist, saavad teadlased suurendada andmete täpsust ja usaldusväärsust. Katse jaoks sobiva fiksaatori valimine parandab teie tulemuste üldist kvaliteeti. Nende parimate tavade rakendamine tagab, et teie voolutsütomeetria analüüs annab järjekindla ja reprodutseeritava ülevaate raku funktsioonidest.
Raku õige fikseerimine mängib võtmerolli voolutsütomeetrias ja toodetes HKeybio pakub usaldusväärseid lahendusi. Nende pakkumine tagab kvaliteetsed tulemused ja teadlased usaldavad neid täpse rakuanalüüsi jaoks kogu maailmas.
KKK
K: Mis tähtsus on rakkude fikseerimisel voolutsütomeetrias?
V: Rakkude fikseerimine on voolutsütomeetrias ülioluline, kuna see säilitab rakustruktuure ning tagab valkude ja DNA terviklikkuse täpse analüüsi jaoks.
K: Kui kaua tuleks rakke voolutsütomeetria jaoks fikseerida?
V: Rakud tuleks tavaliselt 15–30 minutiks fikseerida 2–4% paraformaldehüüdi (PFA) lahusega, et säilitada raku terviklikkus.
K: Kas ma saan kasutada etanooli rakkude fikseerimiseks voolutsütomeetrias?
V: Jah, etanooliga fikseerimist kasutatakse tavaliselt DNA sisu analüüsiks voolutsütomeetrias, eriti rakutsükli uuringutes.
K: Mis juhtub, kui rakud on voolutsütomeetrias liiga fikseeritud?
V: Liigne fikseerimine võib põhjustada liigset ristsidumist, mis viib autofluorestsentsi ja halva antikeha sidumiseni, mis võib mõjutada voolutsütomeetria tulemusi.
