Uvod
Jeste li se ikada zapitali kako protočna citometrija postiže tako preciznu i pouzdanu analizu stanica? Ključ točnih rezultata leži u pravilnoj fiksaciji stanica. Protočna citometrija omogućuje istraživačima proučavanje različitih staničnih karakteristika, od veličine do intenziteta fluorescencije. Međutim, bez odgovarajuće fiksacije, podaci možda neće odražavati stvarna stanična svojstva. U ovom ćemo članku istražiti važnost fiksacije stanica u protočnoj citometriji, raspravljati o različitim metodama fiksacije i podijeliti savjete za optimalne rezultate.
Što je fiksacija stanica u protočnoj citometriji?
Definicija fiksacije stanica
Fiksacija stanica je proces koji stabilizira i čuva stanice sprječavanjem promjena u njihovoj strukturi, funkciji i molekularnom sastavu. Ovaj se proces postiže kemijskim umrežavanjem proteina, lipida i drugih staničnih komponenti, čime se stanice učinkovito 'zamrzavaju' u njihovom trenutnom stanju. Ovo je osobito važno u protočnoj citometriji jer sprječava degradaciju staničnih markera ili promjenu staničnih struktura tijekom analize. Fiksiranjem stanica istraživači mogu osigurati da karakteristike stanica ostanu dosljedne, što omogućuje precizna mjerenja i pouzdane podatke tijekom analize protočnom citometrijom.
Zašto je fiksacija važna
Pravilna fiksacija je ključna jer održava integritet staničnih proteina i nukleinskih kiselina, koji su ključni za točnu analizu protočnom citometrijom. Ako stanice nisu fiksirane, njihova struktura i molekularni markeri mogu degradirati ili se promijeniti tijekom vremena, što dovodi do nepouzdanih i netočnih rezultata. Fiksacija također igra ključnu ulogu u stabilizaciji stanica za višeparametarsku analizu, što je jedna od ključnih prednosti protočne citometrije. Istraživačima omogućuje simultanu procjenu značajki više stanica, kao što su površinski markeri, unutarstanični proteini i sadržaj DNK, u jednom eksperimentu. Bez pravilnog fiksiranja, dobiveni podaci mogu biti nedosljedni ili nepotpuni, što dovodi do pogrešnog tumačenja eksperimentalnih rezultata.
Vrste metoda fiksacije za protočnu citometriju
Fiksacija paraformaldehidom (PFA).
Paraformaldehid (PFA) jedan je od najčešće korištenih fiksativa u protočnoj citometriji, prvenstveno zbog svoje učinkovitosti u očuvanju stanične morfologije i antigenosti. Djeluje umrežavanjem proteina unutar stanica, osiguravajući da i stanična struktura i površinski proteini ostanu netaknuti. To čini PFA izvrsnim izborom za očuvanje površinskih markera stanica, posebno kada se analizira površinska ekspresija proteina u eksperimentima imunofenotipizacije.
Preporuka:
● Koncentracija: 2-4% PFA se obično koristi za optimalnu fiksaciju.
● Vrijeme fiksacije: Stanice treba inkubirati u PFA 15-30 minuta na 2-8°C.
● Čuvanje: Nakon fiksacije, stanice treba čuvati na 2-8°C za kratkotrajno skladištenje. Važno je ne pohranjivati fiksne stanice dulje vrijeme jer to može dovesti do gubitka integriteta markera.
Važno je izbjeći pretjeranu fiksaciju jer produljena izloženost PFA može dovesti do stanične autofluorescencije i ometati naknadno bojenje i analizu. Uvijek koristite minimalno potrebno vrijeme za fiksiranje.
Fiksacija etanolom
Fiksacija etanolom obično se koristi kada je fokus analize na sadržaju DNK, kao što su studije staničnog ciklusa. Etanol je sredstvo za dehidraciju koje djeluje tako da prodire kroz staničnu membranu i čuva DNK unutar stanica. To čini fiksaciju etanolom posebno korisnom za analize temeljene na DNK i analize protočne citometrije gdje se ispituju faze staničnog ciklusa ili sadržaj DNK.
Preporuka:
● Koncentracija: Obično se koristi 70-100% etanol.
● Vrijeme fiksacije: Fiksacija etanolom obično zahtijeva 10-15 minuta za optimalne rezultate.
Fiksacija etanolom idealna je za očuvanje faza staničnog ciklusa, a može se koristiti u kombinaciji s bojama koje vežu DNK, kao što je propidij jodid (PI) za analizu staničnog ciklusa.
Fiksacija metanolom
Metanol je još jedan često korišten fiksativ, posebno za unutarstanične analize. Djeluje tako da prodire kroz staničnu membranu i stabilizira unutarnje strukture stanice. Iako je metanol učinkovit u očuvanju staničnih proteina i antigena, može uzrokovati skupljanje stanica, što može utjecati na tumačenje određenih značajki, kao što su veličina i morfologija stanice.
Preporuka:
● Koncentracija: Obično se koristi 90-100% metanol.
● Vrijeme fiksiranja: obično je dovoljno 10-15 minuta.
Fiksacija metanolom često se koristi kada se proučavaju unutarstanični proteini, posebno kada se ispituju markeri unutar citoplazme ili jezgre. Međutim, istraživači bi trebali uzeti u obzir mogućnost skupljanja stanica pri fiksaciji metanolom.
Ostali fiksativi (npr. formalin)
Formalin, otopina formaldehida u vodi, još je jedan fiksativ koji se koristi u protočnoj citometriji, iako je rjeđi od PFA. Formalin se široko koristi u histologiji i imunohistokemiji, gdje učinkovito čuva uzorke tkiva za mikroskopsku analizu. Iako formalin može očuvati stanične strukture, općenito se ne preporučuje za protočnu citometriju osim ako se ne radi s fiksiranim uzorcima tkiva, jer može ometati razvrstavanje stanica i neke primjene fluorescencije. Formalinska fiksacija je najprikladnija za uzorke tkiva, a ne za pojedinačne stanice.
Fiksativ |
Koncentracija |
Vrijeme fiksiranja |
Preporučena uporaba |
paraformaldehid (PFA) |
2-4% |
15-30 minuta |
Idealno za očuvanje površinskih markera stanica; uobičajeni za imunofenotipizaciju |
Etanol |
70-100% |
10-15 minuta |
Najbolje za analizu sadržaja DNK i studije staničnog ciklusa |
Metanol |
90-100% |
10-15 minuta |
Prikladno za unutarstaničnu analizu proteina; može uzrokovati skupljanje stanica |
Formalin |
10% (formaldehid) |
Varira (ovisi o tkivu) |
Obično se koristi za fiksirane uzorke tkiva, ne za pojedinačne stanice |
Vodič korak po korak za fiksiranje stanica za protočnu citometriju
Priprema uzorka stanica
Prije fiksacije bitno je izolirati stanice iz uzorka tkiva ili krvi. Centrifugiranje je najčešća metoda koja se koristi za koncentriranje stanica u suspenziju. Također je ključno temeljito oprati stanice kako bi se uklonili svi mediji kulture ili zaostali kontaminanti koji bi mogli ometati proces fiksacije.
1. Izolacija stanica: Upotrijebite standardne metode izolacije kao što su centrifugiranje ili razvrstavanje stanica kako biste odvojili stanice od interesa.
2. Pranje: Isperite stanice fiziološkom otopinom s fosfatnim puferom (PBS) kako biste uklonili ostatke medija i onečišćenja koji bi mogli utjecati na proces fiksacije.
Postupak fiksiranja
Nakon što su stanice pripremljene, sljedeći korak je dodavanje fiksativa u suspenziju stanica. Najčešće korišten fiksativ za protočnu citometriju je 2-4% otopina PFA.
1. Dodajte fiksativ u suspenziju stanica, pazeći da je dobro izmiješan.
2. Inkubirajte stanice s fiksativom 15-30 minuta na 2-8°C.
3. Nakon inkubacije, dvaput isperite stanice s PBS-om kako biste uklonili višak sredstva za fiksiranje.
Koraci nakon fiksacije
Nakon fiksacije, stanicama se mora pažljivo rukovati. Ako je potrebna daljnja analiza, stanice treba obojiti prije analize. Ako planirate pohraniti stanice za buduću analizu, resuspendirajte ih u odgovarajućem puferu i pohranite na 2-8°C. Izbjegavajte ostavljati stanice u fiksativu dulje vrijeme jer prekomjerna fiksacija može dovesti do povećane autofluorescencije i smanjene kvalitete signala.
Savjeti za optimalnu fiksaciju u protočnoj citometriji
Izbjegavanje pretjerane fiksacije
Do pretjerane fiksacije dolazi kada su stanice predugo izložene fiksativu, što može rezultirati pretjeranim umrežavanjem staničnih proteina i ugroziti kvalitetu podataka. To može dovesti do autofluorescencije, smanjenog vezanja protutijela i netočnih mjerenja protočne citometrije. Uvijek provjerite preporučena vremena fiksacije za vašu specifičnu vrstu stanica i eksperimentirajte kako biste izbjegli pretjeranu fiksaciju.
Vrijeme fiksiranja u odnosu na vrstu uzorka
Optimalno vrijeme fiksacije može varirati ovisno o vrsti stanice i prirodi eksperimenta. Na primjer, imunološke stanice mogu zahtijevati kraće vrijeme fiksacije nego uzorci tkiva. Prilagodite vrijeme fiksiranja na temelju specifičnih potreba vrste uzorka. Za površinsku analizu proteina obično je dovoljno kraće vrijeme fiksacije (10-15 minuta). Za intracelularno bojenje ili analizu DNK može biti potrebno dulje vrijeme fiksacije.
Bojenje nakon fiksacije
Nakon fiksiranja stanica, bojenje antitijelima ili fluorescentnim bojama kritičan je korak u analizi protočne citometrije. Neke fluorescentne boje, osobito tandem boje, mogu biti osjetljive na fiksaciju i mogu se razgraditi ako su stanice previše fiksirane. Za optimalne rezultate bojenja, preporučuje se bojenje stanica prije fiksacije kad god je to moguće. To može spriječiti degradaciju boje i osigurati jače fluorescentne signale.
Pohranjivanje fiksnih stanica za protočnu citometriju
Kratkotrajno skladištenje
Za kratkotrajno skladištenje, fiksirane ćelije mogu se čuvati u hladnjaku na 2-8°C. Ovo je idealno kada planirate analizirati stanice unutar dan ili dva nakon fiksacije. Uvijek pohranjujte fiksne ćelije u mraku kako biste spriječili fotoizbjeljivanje koje može utjecati na fluorescentne signale.
Dugoročno skladištenje
Za dugotrajnu pohranu, stanice se mogu zamrznuti u mediju za kriokonzervaciju. Tipični medij za krioprezervaciju sastoji se od 10% dimetil sulfoksida (DMSO) i 90% fetalnog goveđeg seruma (FBS). Međutim, rješenja za krioprezervaciju bez seruma kao što su mFreSR™ ili CryoStor™ CS10 također su dostupna i mogu se koristiti za izbjegavanje problema povezanih s FBS-om. Da biste spriječili stvaranje kristala leda, koristite zamrzivač s kontroliranom brzinom za zamrzavanje stanica. To pomaže u održavanju održivosti stanica i osigurava pravilno skladištenje.
Uobičajene zamke koje treba izbjegavati u fiksaciji stanica za protočnu citometriju
Učinci nepravilne fiksacije
Neodgovarajuća fiksacija može dovesti do nekoliko problema, uključujući autofluorescenciju, smanjeno vezanje protutijela i slabu vitalnost stanica. Ovi problemi mogu značajno utjecati na točnost i pouzdanost rezultata protočne citometrije. Uvijek provjerite protokole fiksacije za vašu specifičnu vrstu uzorka i osigurajte da su uvjeti fiksacije prikladni za vrstu ćelije i markere koji se analiziraju.
Odabir pravog fiksativa za vašu primjenu
Odabir odgovarajućeg fiksativa za vaš eksperiment protočne citometrije ključan je za dobivanje pouzdanih i točnih rezultata. Različiti fiksativi su prikladniji za različite primjene. Na primjer, PFA se obično koristi za površinsku analizu proteina, dok je etanol idealan za studije temeljene na DNK. Prije početka eksperimenta istražite najbolji fiksativ za svoju specifičnu primjenu i prema tome prilagodite protokol fiksacije.
Zaključak
Pravilna fiksacija stanica ključna je za postizanje uspješne analize protočnom citometrijom. Pomaže u očuvanju staničnih struktura i osigurava cjelovitost proteina i DNK. Slijedeći ispravne protokole fiksacije i izbjegavajući pretjeranu fiksaciju, istraživači mogu poboljšati točnost i pouzdanost podataka. Odabir odgovarajućeg fiksativa za vaš eksperiment poboljšava ukupnu kvalitetu vaših rezultata. Primjena ovih najboljih praksi osigurava da vaša analiza protočne citometrije pruža dosljedne, ponovljive uvide u stanične funkcije.
Pravilna fiksacija stanica igra ključnu ulogu u protočnoj citometriji, a proizvodi iz HKeybio nudi pouzdana rješenja. Njihova ponuda osigurava rezultate visoke kvalitete i istraživači diljem svijeta imaju povjerenje u točnu analizu stanica.
FAQ
P: Koja je važnost fiksacije stanica u protočnoj citometriji?
O: Fiksacija stanica ključna je u protočnoj citometriji jer čuva stanične strukture i osigurava integritet proteina i DNK za točnu analizu.
P: Koliko dugo stanice trebaju biti fiksirane za protočnu citometriju?
O: Stanice se obično trebaju fiksirati 15-30 minuta s 2-4% otopinom paraformaldehida (PFA) kako bi se održao stanični integritet.
P: Mogu li koristiti etanol za fiksaciju stanica u protočnoj citometriji?
O: Da, fiksacija etanolom se obično koristi za analizu sadržaja DNK u protočnoj citometriji, posebno za studije staničnog ciklusa.
P: Što se događa ako su stanice previše fiksirane u protočnoj citometriji?
O: Pretjerana fiksacija može uzrokovati prekomjerno umrežavanje, što dovodi do autofluorescencije i slabog vezanja protutijela, što može utjecati na rezultate protočne citometrije.
