بہاؤ سائٹومیٹری کے لئے خلیوں کو کیسے ٹھیک کریں

تعارف

کیا آپ نے کبھی سوچا ہے کہ کیسے؟ فلو سائٹوومیٹری اس طرح کے عین مطابق اور قابل اعتماد سیل تجزیہ حاصل کرتا ہے؟ درست نتائج کی کلید مناسب سیل طے کرنے میں ہے۔ فلو سائٹوومیٹری محققین کو سائز سے فلوروسینس کی شدت تک متعدد سیلولر خصوصیات کا مطالعہ کرنے کی اجازت دیتی ہے۔ تاہم ، مناسب تعی .ن کے بغیر ، اعداد و شمار حقیقی سیلولر خصوصیات کی عکاسی نہیں کرسکتے ہیں۔ اس مضمون میں ، ہم بہاؤ سائٹوومیٹری میں سیل فکسشن کی اہمیت کو دریافت کریں گے ، مختلف فکسنگ طریقوں پر تبادلہ خیال کریں گے ، اور زیادہ سے زیادہ نتائج کے ل tips اشارے شیئر کریں گے۔

 

فلو سائٹوومیٹری میں سیل فکسشن کیا ہے؟

سیل فکسشن کی تعریف

سیل فکسنگ ایک ایسا عمل ہے جو خلیوں کو ان کی ساخت ، فنکشن اور سالماتی ساخت میں تبدیلیوں کو روکتا ہے اور محفوظ کرتا ہے۔ یہ عمل کیمیائی طور پر کراس سے منسلک پروٹین ، لپڈس ، اور دیگر سیلولر اجزاء کے ذریعہ حاصل کیا جاتا ہے ، جو مؤثر طریقے سے ان کی موجودہ حالت میں موجود خلیوں کو 'منجمد کرنا ' ہے۔ یہ بہاؤ سائٹوومیٹری میں خاص طور پر اہم ہے کیونکہ یہ تجزیہ کے دوران سیلولر مارکروں کے انحطاط یا سیلولر ڈھانچے میں ردوبدل کو روکتا ہے۔ خلیوں کو ٹھیک کرکے ، محققین اس بات کو یقینی بناسکتے ہیں کہ خلیوں کی خصوصیات مستقل رہیں ، جو بہاؤ سائٹوومیٹری تجزیہ کے دوران عین مطابق پیمائش اور قابل اعتماد اعداد و شمار کی اجازت دیتی ہیں۔

فکسنگ کیوں ضروری ہے

مناسب تعی .ن ضروری ہے کیونکہ یہ سیلولر پروٹین اور نیوکلک ایسڈ کی سالمیت کو برقرار رکھتا ہے ، جو درست بہاؤ سائٹوومیٹری تجزیہ کے لئے اہم ہیں۔ اگر خلیوں کو طے نہیں کیا جاتا ہے تو ، ان کی ساخت اور سالماتی مارکر وقت کے ساتھ ساتھ ہراس یا تبدیل ہوسکتے ہیں ، جس کی وجہ سے ناقابل اعتماد اور غلط نتائج برآمد ہوسکتے ہیں۔ کثیر پیرامیٹر تجزیہ کے لئے خلیوں کو مستحکم کرنے میں بھی فکسشن اہم کردار ادا کرتا ہے ، جو بہاؤ سائٹومیٹری کی کلیدی طاقت میں سے ایک ہے۔ یہ محققین کو ایک ہی تجربے میں ایک ساتھ متعدد سیل خصوصیات ، جیسے سطح کے مارکر ، انٹرا سیلولر پروٹین ، اور ڈی این اے مواد کا اندازہ کرنے کی اجازت دیتا ہے۔ مناسب تعی .ن کے بغیر ، حاصل کردہ اعداد و شمار متضاد یا نامکمل ہوسکتے ہیں ، جس کی وجہ سے تجرباتی نتائج کی غلط تشریح ہوتی ہے۔

 

بہاؤ cytometry کے لئے طے کرنے کے طریقوں کی اقسام

پیرافارمیلڈہائڈ (پی ایف اے) فکسشن

پیرافارمیلڈہائڈ (پی ایف اے) بہاؤ سائٹوومیٹری میں سب سے زیادہ استعمال ہونے والے فکسٹیوز میں سے ایک ہے ، بنیادی طور پر سیل مورفولوجی اور antigenicity کے تحفظ میں اس کی تاثیر کی وجہ سے۔ یہ خلیوں کے اندر کراس سے منسلک پروٹینوں کے ذریعہ کام کرتا ہے ، اس بات کو یقینی بناتا ہے کہ سیلولر ڈھانچہ اور سطح کے پروٹین دونوں برقرار رہیں۔ یہ پی ایف اے کو سیل سطح کے مارکروں کے تحفظ کے ل an ایک بہترین انتخاب بناتا ہے ، خاص طور پر جب امیونوفینوٹائپنگ تجربات میں سطح کے پروٹین کے اظہار کا تجزیہ کریں۔

سفارش:

● حراستی: 2-4 ٪ PFA عام طور پر زیادہ سے زیادہ تعی .ن کے لئے استعمال ہوتا ہے۔

● فکسنگ ٹائم: خلیوں کو پی ایف اے میں 15-30 منٹ کے لئے 2-8 ° C پر انکیوبیٹ کیا جانا چاہئے۔

● اسٹوریج: طے کرنے کے بعد ، خلیوں کو قلیل مدتی اسٹوریج کے لئے 2-8 ° C پر رکھنا چاہئے۔ یہ ضروری ہے کہ توسیع شدہ ادوار کے لئے مقررہ خلیوں کو ذخیرہ نہ کریں ، کیونکہ اس سے مارکر کی سالمیت کا نقصان ہوسکتا ہے۔

زیادہ فکسشن سے بچنا ضروری ہے ، کیونکہ پی ایف اے کے طویل عرصے سے نمائش سیلولر آٹو فلوروسینس کا باعث بن سکتی ہے اور اس کے نتیجے میں داغ اور تجزیہ میں مداخلت کرسکتی ہے۔ طے کرنے کے لئے ہمیشہ کم سے کم مطلوبہ وقت کا استعمال کریں۔

ایتھنول طے کرنا

ایتھنول فکسشن عام طور پر اس وقت استعمال ہوتا ہے جب تجزیہ کی توجہ ڈی این اے مواد پر ہوتی ہے ، جیسے سیل سائیکل اسٹڈیز میں۔ ایتھنول ایک پانی کی کمی کا ایجنٹ ہے جو خلیوں کی جھلی کو گھسنے اور خلیوں کے اندر ڈی این اے کو محفوظ کرکے کام کرتا ہے۔ اس سے ایتھنول فکسشن کو خاص طور پر ڈی این اے پر مبنی اسیس اور فلو سائٹوومیٹری کے تجزیہ کے ل useful مفید بناتا ہے جہاں سیل سائیکل کے مراحل یا ڈی این اے مواد کی جانچ کی جارہی ہے۔

سفارش:

● حراستی: عام طور پر ، 70-100 ٪ ایتھنول استعمال ہوتا ہے۔

● فکسنگ ٹائم: ایتھنول فکسشن کو عام طور پر زیادہ سے زیادہ نتائج کے ل 10 10-15 منٹ کی ضرورت ہوتی ہے۔

ایتھنول طے کرنا سیل سائیکل کے مراحل کو محفوظ رکھنے کے لئے مثالی ہے ، اور اسے سیل سائیکل تجزیہ کے لئے پروپیڈیم آئوڈائڈ (PI) جیسے ڈی این اے بائنڈنگ رنگوں کے ساتھ مل کر استعمال کیا جاسکتا ہے۔

میتھانول طے کرنا

میتھانول ایک اور عام طور پر استعمال ہونے والا فکسیٹیو ہے ، خاص طور پر انٹرا سیلولر تجزیوں کے لئے۔ یہ سیل کی جھلی کو گھسنے اور سیل کے اندرونی ڈھانچے کو مستحکم کرنے سے کام کرتا ہے۔ اگرچہ میتھانول سیلولر پروٹین اور اینٹیجنوں کو محفوظ رکھنے میں موثر ہے ، لیکن یہ سیل سکڑنے کا سبب بن سکتا ہے ، جو کچھ خصوصیات کی ترجمانی پر اثر انداز ہوسکتا ہے ، جیسے سیل سائز اور مورفولوجی۔

سفارش:

● حراستی: عام طور پر ، 90-100 ٪ میتھانول استعمال ہوتا ہے۔

● تعی .ن کا وقت: 10-15 منٹ عام طور پر کافی ہوتا ہے۔

انٹرا سیلولر پروٹین کا مطالعہ کرتے وقت میتھانول فکسشن اکثر استعمال کیا جاتا ہے ، خاص طور پر جب سائٹوپلازم یا نیوکلئس کے اندر مارکروں کی جانچ پڑتال کرتے ہیں۔ تاہم ، محققین کو میتھانول فکسشن کا استعمال کرتے وقت سیل سکڑنے کی صلاحیت پر غور کرنا چاہئے۔

دیگر فکسٹیو (جیسے ، فارملین)

فارملین ، جو پانی میں فارملڈہائڈ کا ایک حل ہے ، بہاؤ سائٹوومیٹری میں استعمال ہونے والا ایک اور فکسٹیو ہے ، حالانکہ یہ پی ایف اے سے کم عام ہے۔ فارملین بڑے پیمانے پر ہسٹولوجی اور امیونو ہسٹو کیمسٹری میں استعمال ہوتا ہے ، جہاں یہ مائکروسکوپک تجزیہ کے لئے ٹشو کے نمونوں کو مؤثر طریقے سے محفوظ رکھتا ہے۔ اگرچہ فارملین سیل کے ڈھانچے کو محفوظ رکھ سکتا ہے ، لیکن عام طور پر اس کی سفارش نہیں کی جاتی ہے جب تک کہ فکسڈ ٹشو کے نمونوں کے ساتھ کام نہ کریں ، کیونکہ یہ سیل کی چھانٹائی اور کچھ فلوروسینس ایپلی کیشنز میں مداخلت کرسکتا ہے۔ فارملین فکسشن ٹشو کے نمونوں کے لئے بہترین موزوں ہے ، انفرادی خلیوں کے لئے نہیں۔

 

طے شدہ	حراستی	تعی .ن کا وقت	تجویز کردہ استعمال
پیرافارمیلڈہائڈ (پی ایف اے)	2-4 ٪	15-30 منٹ	سیل سطح کے مارکروں کے تحفظ کے لئے مثالی ؛ امیونوفینوٹائپنگ کے لئے عام ہے
ایتھنول	70-100 ٪	10-15 منٹ	ڈی این اے مواد کے تجزیہ اور سیل سائیکل اسٹڈیز کے لئے بہترین
میتھانول	90-100 ٪	10-15 منٹ	انٹرا سیلولر پروٹین تجزیہ کے لئے موزوں ؛ سیل سکڑنے کا سبب بن سکتا ہے
فارملین	10 ٪ (فارملڈہائڈ)	مختلف ہوتا ہے (ٹشو پر منحصر ہوتا ہے)	عام طور پر فکسڈ ٹشو کے نمونوں کے لئے استعمال کیا جاتا ہے ، انفرادی خلیوں کے لئے نہیں

 

بہاؤ سائٹومیٹری کے لئے خلیوں کو ٹھیک کرنے کے لئے مرحلہ وار گائیڈ

سیل کے نمونے کی تیاری

طے کرنے سے پہلے ، خلیوں کو ٹشو یا خون کے نمونے سے الگ کرنا ضروری ہے۔ سنٹرفیوگریشن سب سے عام طریقہ ہے جو معطلی میں خلیوں کو مرتکز کرنے کے لئے استعمال ہوتا ہے۔ کسی بھی ثقافت کے میڈیا یا بقایا آلودگیوں کو دور کرنے کے لئے خلیوں کو اچھی طرح دھونے کے لئے بھی ضروری ہے ، جو فکسنگ کے عمل میں مداخلت کرسکتا ہے۔

 

1. سیل تنہائی: دلچسپی کے خلیوں کو الگ کرنے کے لئے معیاری تنہائی کے طریقوں جیسے سنٹرفیوگریشن یا سیل چھانٹنا۔

2. دھونے: خلیوں کو فاسفیٹ بفرڈ نمکین (پی بی ایس) سے دھونے کے لئے بقایا میڈیا اور آلودگیوں کو دور کرنے کے لئے جو طے کرنے کے عمل کو متاثر کرسکتے ہیں۔

تعی .ن کا طریقہ کار

ایک بار خلیات تیار ہونے کے بعد ، اگلا مرحلہ یہ ہے کہ سیل معطلی میں فکسٹیو کو شامل کیا جائے۔ بہاؤ cytometry کے لئے سب سے زیادہ عام طور پر استعمال ہونے والا فکسٹیو 2-4 ٪ PFA حل ہے۔

1. سیل معطلی میں فکسٹیو شامل کریں ، اس بات کو یقینی بنائیں کہ یہ اچھی طرح سے ملا ہوا ہے۔

2. خلیوں کو 2-8 ° C پر 15-30 منٹ کے لئے فکسٹیو کے ساتھ انکیوبیٹ کریں۔

3. انکیوبیشن کے بعد ، اضافی فکسٹیٹو کو دور کرنے کے لئے خلیوں کو دو بار پی بی ایس کے ساتھ دھوئے۔

فکسیشن کے بعد کے اقدامات

تعی .ن کے بعد ، خلیوں کو احتیاط سے سنبھالا جانا چاہئے۔ اگر مزید تجزیہ کی ضرورت ہو تو ، تجزیہ سے پہلے خلیوں کو داغدار ہونا چاہئے۔ اگر آپ مستقبل کے تجزیے کے لئے خلیوں کو ذخیرہ کرنے کا ارادہ رکھتے ہیں تو ، انہیں مناسب بفر میں دوبارہ پیش کریں اور انہیں 2-8 ° C پر اسٹور کریں۔ طویل عرصے تک خلیوں کو فکسٹیو میں چھوڑنے سے پرہیز کریں ، کیونکہ زیادہ سے زیادہ فکسشن میں آٹو فلوروسینس میں اضافہ اور سگنل کے معیار کو کم کرنے کا باعث بن سکتا ہے۔

 

بہاؤ cytometry میں زیادہ سے زیادہ تعی .ن کے لئے نکات

زیادہ فکسشن سے گریز کرنا

اوور فکسیشن اس وقت ہوتا ہے جب خلیوں کو بہت لمبے عرصے تک فکسیٹیو کے سامنے لایا جاتا ہے ، جس کے نتیجے میں سیلولر پروٹینوں سے ضرورت سے زیادہ کراس سے منسلک ہونے اور اعداد و شمار کے معیار پر سمجھوتہ ہوسکتا ہے۔ اس سے آٹو فلوروسینس ، کم اینٹی باڈی بائنڈنگ ، اور غلط بہاؤ سائٹوومیٹری پیمائش کا باعث بن سکتا ہے۔ ہمیشہ سے زیادہ فکسشن سے بچنے کے ل your آپ کے مخصوص سیل کی قسم اور تجربے کے لئے تجویز کردہ فکسنگ ٹائم چیک کریں۔

طے شدہ وقت بمقابلہ نمونہ کی قسم

سیل کی قسم اور تجربے کی نوعیت کے لحاظ سے زیادہ سے زیادہ تعی .ن کا وقت مختلف ہوسکتا ہے۔ مثال کے طور پر ، مدافعتی خلیوں کو ٹشو کے نمونوں سے کم تعی .ن کے اوقات کی ضرورت پڑسکتی ہے۔ نمونے کی قسم کی مخصوص ضروریات کی بنیاد پر فکسنگ ٹائم کو ایڈجسٹ کریں۔ سطح پروٹین تجزیہ کے ل a ، ایک چھوٹا سا تعی .ن وقت (10-15 منٹ) عام طور پر کافی ہوتا ہے۔ انٹرا سیلولر داغ یا ڈی این اے تجزیہ کے ل fix ، طویل تعی .ن کا وقت درکار ہوسکتا ہے۔

تعی .ن کے بعد داغ

خلیوں کو ٹھیک کرنے کے بعد ، اینٹی باڈیز یا فلوروسینٹ رنگوں سے داغ لگانا بہاؤ سائٹوومیٹری تجزیہ میں ایک اہم قدم ہے۔ کچھ فلوروسینٹ رنگ ، خاص طور پر ٹینڈم رنگ ، فکسنگ کے ل sensitive حساس ہوسکتے ہیں اور اگر خلیوں کو زیادہ سے زیادہ فکس کیا جاتا ہے تو اس میں کمی آسکتی ہے۔ زیادہ سے زیادہ داغدار نتائج کے ل it ، جب بھی ممکن ہو تو فکسشن سے پہلے خلیوں کو داغ لگانے کی سفارش کی جاتی ہے۔ اس سے رنگنے کے انحطاط کو روکنے اور مضبوط فلوروسینس سگنل کو یقینی بنانے میں مدد مل سکتی ہے۔

 

فلو سائٹومیٹری کے لئے فکسڈ سیلز کو ذخیرہ کرنا

قلیل مدتی اسٹوریج

قلیل مدتی اسٹوریج کے ل fixed ، فکسڈ خلیوں کو ریفریجریٹر میں 2-8 ° C پر محفوظ کیا جاسکتا ہے۔ یہ مثالی ہے جب آپ فکسنگ کے بعد ایک یا دو دن کے اندر خلیوں کا تجزیہ کرنے کا ارادہ کرتے ہیں۔ فوٹو بلوچنگ کو روکنے کے لئے ہمیشہ اندھیرے میں فکسڈ خلیوں کو ذخیرہ کریں ، جو فلوروسینٹ سگنلز کو متاثر کرسکتا ہے۔

طویل مدتی اسٹوریج

طویل مدتی اسٹوریج کے ل cry ، کریوپریسرویشن میڈیا میں خلیوں کو منجمد کیا جاسکتا ہے۔ ایک عام کریوپریژریشن میڈیم 10 dim ڈیمیتھائل سلفوکسائڈ (ڈی ایم ایس او) اور 90 ٪ برانن بوائین سیرم (ایف بی ایس) پر مشتمل ہے۔ تاہم ، سیرم فری کریوپریژرویشن حل جیسے ایم ایف آر ای آر ایس آر ™ یا کرائوسٹور ™ سی ایس 10 بھی دستیاب ہیں اور ایف بی ایس سے وابستہ مسائل سے بچنے کے لئے استعمال کیا جاسکتا ہے۔ آئس کرسٹل کی تشکیل کو روکنے کے لئے ، خلیوں کو منجمد کرنے کے لئے ایک کنٹرول ریٹ ریٹ فریزر استعمال کریں۔ اس سے سیل کی اہلیت کو برقرار رکھنے میں مدد ملتی ہے اور مناسب اسٹوریج کو یقینی بنایا جاتا ہے۔

 

بہاؤ cytometry کے لئے سیل طے کرنے سے بچنے کے لئے عام خرابیاں

نامناسب تعی .ن کے اثرات

نامناسب تعی .ن متعدد مسائل کا باعث بن سکتا ہے ، بشمول آٹوفلوورسینس ، کم اینٹی باڈی بائنڈنگ ، اور سیل کی ناقص صلاحیت۔ یہ مسائل بہاؤ سائٹومیٹری کے نتائج کی درستگی اور وشوسنییتا کو نمایاں طور پر متاثر کرسکتے ہیں۔ اپنے مخصوص نمونے کی قسم کے ل furc ہمیشہ فکسشن پروٹوکول کی تصدیق کریں ، اور اس بات کو یقینی بنائیں کہ سیل کی قسم اور مارکروں کے تجزیہ کے ل fus فکسنگ کے حالات مناسب ہیں۔

اپنی درخواست کے لئے صحیح فکسٹیو کا انتخاب کرنا

قابل اعتماد اور درست نتائج حاصل کرنے کے لئے اپنے بہاؤ سائٹومیٹری کے تجربے کے لئے مناسب فکسٹیو کا انتخاب بہت ضروری ہے۔ مختلف ایپلی کیشنز کے ل different مختلف فکسٹیو بہتر موزوں ہیں۔ مثال کے طور پر ، پی ایف اے عام طور پر سطح کے پروٹین کے تجزیے کے لئے استعمال ہوتا ہے ، جبکہ ایتھنول ڈی این اے پر مبنی مطالعات کے لئے مثالی ہے۔ تجربے سے پہلے ، اپنی مخصوص درخواست کے لئے بہترین فکسٹیو کی تحقیق کریں اور اسی کے مطابق فکسشن پروٹوکول کو ایڈجسٹ کریں۔

 

نتیجہ

کامیاب بہاؤ سائٹومیٹری تجزیہ کے حصول کے لئے مناسب سیل فکسشن ضروری ہے۔ یہ سیلولر ڈھانچے کو محفوظ رکھنے میں مدد کرتا ہے اور پروٹین اور ڈی این اے کی سالمیت کو یقینی بناتا ہے۔ مناسب تعی .ن پروٹوکول پر عمل کرنے اور زیادہ سے زیادہ فکسشن سے گریز کرکے ، محققین اعداد و شمار کی درستگی اور وشوسنییتا کو بڑھا سکتے ہیں۔ اپنے تجربے کے لئے مناسب فکسٹیو کا انتخاب آپ کے نتائج کے مجموعی معیار کو بہتر بناتا ہے۔ ان بہترین طریقوں پر عمل درآمد یقینی بناتا ہے کہ آپ کا بہاؤ سائٹوومیٹری تجزیہ سیلولر افعال میں مستقل ، تولیدی بصیرت فراہم کرتا ہے۔

 

مناسب سیل فکسشن فلو سائٹومیٹری ، اور مصنوعات میں کلیدی کردار ادا کرتا ہے Hkeybio قابل اعتماد حل پیش کرتا ہے۔ ان کی پیش کش اعلی معیار کے نتائج کو یقینی بناتی ہے اور سیل کے درست تجزیہ کے لئے دنیا بھر کے محققین کے ذریعہ ان پر اعتماد کیا جاتا ہے۔

 

سوالات

س: بہاؤ سائٹومیٹری میں سیل فکسشن کی کیا اہمیت ہے؟

A: سیل فکسنگ بہاؤ cytometry میں بہت ضروری ہے کیونکہ یہ سیلولر ڈھانچے کو محفوظ رکھتا ہے اور درست تجزیہ کے لئے پروٹین اور ڈی این اے کی سالمیت کو یقینی بناتا ہے۔

س: بہاؤ سائٹومیٹری کے لئے خلیوں کو کب تک طے کیا جانا چاہئے؟

A: سیلولر سالمیت کو برقرار رکھنے کے لئے عام طور پر خلیوں کو 2-4 ٪ پیرافارمیلڈہائڈ (پی ایف اے) حل کے ساتھ 15-30 منٹ کے لئے طے کیا جانا چاہئے۔

س: کیا میں بہاؤ سائٹومیٹری میں سیل فکسشن کے لئے ایتھنول استعمال کرسکتا ہوں؟

A: ہاں ، ایتھنول فکسشن عام طور پر بہاؤ cytometry میں DNA مواد کے تجزیہ کے لئے استعمال ہوتا ہے ، خاص طور پر سیل سائیکل کے مطالعے کے لئے۔

س: اگر خلیوں کو بہاؤ سائٹومیٹری میں زیادہ سے زیادہ طے کیا جاتا ہے تو کیا ہوتا ہے؟

A: زیادہ سے زیادہ فکسشن ضرورت سے زیادہ کراس سے منسلک ہونے کا سبب بن سکتا ہے ، جس کی وجہ سے آٹو فلوروسینس اور ناقص اینٹی باڈی بائنڈنگ کا باعث بنتا ہے ، جو بہاؤ سائٹومیٹری کے نتائج کو متاثر کرسکتا ہے۔