วิธีแก้ไขเซลล์สำหรับ Flow Cytometry

การแนะนำ

คุณเคยสงสัยบ้างไหมว่าเป็นอย่างไร Flow Cytometry ช่วยให้การวิเคราะห์เซลล์แม่นยำและเชื่อถือได้เช่นนั้นหรือไม่ กุญแจสำคัญสู่ผลลัพธ์ที่แม่นยำอยู่ที่การตรึงเซลล์อย่างเหมาะสม Flow cytometry ช่วยให้นักวิจัยสามารถศึกษาคุณลักษณะของเซลล์ที่หลากหลาย ตั้งแต่ขนาดไปจนถึงความเข้มของแสงเรืองแสง อย่างไรก็ตาม หากไม่มีการตรึงอย่างเหมาะสม ข้อมูลอาจไม่สะท้อนถึงคุณสมบัติของเซลล์ที่แท้จริง ในบทความนี้ เราจะสำรวจความสำคัญของการตรึงเซลล์ในโฟลไซโตเมทรี อภิปรายการวิธีการตรึงแบบต่างๆ และแบ่งปันเคล็ดลับเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด

 

การตรึงเซลล์ใน Flow Cytometry คืออะไร

คำจำกัดความของการตรึงเซลล์

การตรึงเซลล์เป็นกระบวนการที่ทำให้เซลล์คงตัวและรักษาไว้โดยป้องกันการเปลี่ยนแปลงโครงสร้าง หน้าที่ และองค์ประกอบทางโมเลกุล กระบวนการนี้เกิดขึ้นได้โดยการเชื่อมโยงข้ามโปรตีน ลิพิด และส่วนประกอบของเซลล์อื่นๆ ทางเคมี ส่งผลให้ 'แช่แข็ง' เซลล์ในสถานะปัจจุบันได้อย่างมีประสิทธิภาพ สิ่งนี้มีความสำคัญอย่างยิ่งในโฟลว์ไซโตเมทรีเพราะจะป้องกันการเสื่อมสภาพของเครื่องหมายเซลล์หรือการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างเซลล์ในระหว่างการวิเคราะห์ นักวิจัยสามารถรับประกันได้ว่าคุณลักษณะของเซลล์จะยังคงเดิมด้วยการซ่อมแซมเซลล์ ซึ่งช่วยให้สามารถตรวจวัดได้อย่างแม่นยำและข้อมูลที่เชื่อถือได้ในระหว่างการวิเคราะห์โฟลไซโตเมทรี

เหตุใดการตรึงจึงมีความสำคัญ

การตรึงที่เหมาะสมถือเป็นสิ่งสำคัญเนื่องจากจะรักษาความสมบูรณ์ของโปรตีนในเซลล์และกรดนิวคลีอิก ซึ่งมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีที่แม่นยำ หากเซลล์ไม่ได้รับการแก้ไข โครงสร้างและเครื่องหมายโมเลกุลอาจเสื่อมหรือเปลี่ยนแปลงเมื่อเวลาผ่านไป นำไปสู่ผลลัพธ์ที่ไม่น่าเชื่อถือและไม่ถูกต้อง การตรึงยังมีบทบาทสำคัญในการรักษาเสถียรภาพของเซลล์สำหรับการวิเคราะห์หลายพารามิเตอร์ ซึ่งเป็นหนึ่งในจุดแข็งสำคัญของโฟลว์ไซโตเมทรี ช่วยให้นักวิจัยประเมินคุณลักษณะต่างๆ ของเซลล์ เช่น เครื่องหมายพื้นผิว โปรตีนในเซลล์ และปริมาณ DNA ได้พร้อมๆ กันในการทดลองครั้งเดียว หากไม่มีการแก้ไขอย่างเหมาะสม ข้อมูลที่ได้รับอาจไม่สอดคล้องกันหรือไม่สมบูรณ์ นำไปสู่การตีความผลการทดลองที่ไม่ถูกต้อง

 

ประเภทของวิธีการตรึงสำหรับโฟลว์ไซโตเมทรี

การตรึงพาราฟอร์มัลดีไฮด์ (PFA)

พาราฟอร์มัลดีไฮด์ (PFA) เป็นหนึ่งในสารตรึงที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในโฟลว์ไซโตเมทรี สาเหตุหลักมาจากประสิทธิภาพในการรักษาสัณฐานวิทยาของเซลล์และแอนติเจน มันทำงานโดยการเชื่อมโยงโปรตีนภายในเซลล์ ทำให้มั่นใจว่าทั้งโครงสร้างเซลล์และโปรตีนบนพื้นผิวยังคงสภาพเดิม สิ่งนี้ทำให้ PFA เป็นตัวเลือกที่ยอดเยี่ยมสำหรับการรักษาเครื่องหมายบนผิวเซลล์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อวิเคราะห์การแสดงออกของโปรตีนบนพื้นผิวในการทดลองอิมมูโนฟีโนไทป์

คำแนะนำ:

● ความเข้มข้น: โดยทั่วไปจะใช้ PFA 2-4% เพื่อการตรึงที่เหมาะสมที่สุด

● เวลาตรึง: เซลล์ควรบ่มใน PFA เป็นเวลา 15-30 นาที ที่อุณหภูมิ 2-8°C

● การเก็บรักษา: หลังจากการตรึงเซลล์ควรเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 2-8°C สำหรับการเก็บรักษาระยะสั้น สิ่งสำคัญคือต้องไม่เก็บเซลล์ที่ตายตัวไว้เป็นเวลานาน เนื่องจากอาจทำให้สูญเสียความสมบูรณ์ของเครื่องหมายได้

สิ่งสำคัญคือต้องหลีกเลี่ยงการตรึงมากเกินไป เนื่องจากการสัมผัสกับ PFA เป็นเวลานานสามารถนำไปสู่การเรืองแสงอัตโนมัติของเซลล์ และรบกวนการย้อมสีและการวิเคราะห์ในภายหลัง ใช้เวลาในการซ่อมตามระยะเวลาขั้นต่ำเสมอ

การตรึงเอทานอล

การตรึงเอทานอลมักใช้เมื่อการวิเคราะห์มุ่งเน้นไปที่ปริมาณ DNA เช่น ในการศึกษาวัฏจักรของเซลล์ เอทานอลเป็นสารช่วยขจัดน้ำออกซึ่งทำงานโดยการเจาะเยื่อหุ้มเซลล์และรักษา DNA ภายในเซลล์ สิ่งนี้ทำให้การตรึงเอทานอลมีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับการตรวจวิเคราะห์โดยใช้ DNA และการวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีซึ่งมีการตรวจสอบระยะวัฏจักรของเซลล์หรือปริมาณ DNA

คำแนะนำ:

● ความเข้มข้น: โดยทั่วไปจะใช้เอธานอล 70-100%

● เวลาตรึง: โดยทั่วไปการตรึงเอทานอลต้องใช้เวลา 10-15 นาทีเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด

การตรึงเอทานอลเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการรักษาระยะวัฏจักรของเซลล์ และสามารถใช้ร่วมกับสีย้อมที่จับกับ DNA เช่น โพรพิเดียม ไอโอไดด์ (PI) เพื่อการวิเคราะห์วัฏจักรของเซลล์

การตรึงเมทานอล

เมทานอลเป็นสารตรึงที่ใช้กันทั่วไปอีกชนิดหนึ่ง โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการวิเคราะห์ภายในเซลล์ มันทำงานโดยการเจาะเยื่อหุ้มเซลล์และทำให้โครงสร้างภายในของเซลล์มีความเสถียร แม้ว่าเมทานอลจะมีประสิทธิภาพในการรักษาโปรตีนและแอนติเจนของเซลล์ แต่ก็อาจทำให้เซลล์หดตัว ซึ่งอาจส่งผลต่อการตีความคุณลักษณะบางอย่าง เช่น ขนาดของเซลล์และสัณฐานวิทยา

คำแนะนำ:

● ความเข้มข้น: โดยทั่วไป จะใช้เมทานอล 90-100%

● เวลาตรึง: ปกติแล้ว 10-15 นาทีก็เพียงพอแล้ว

การตรึงเมทานอลมักใช้เมื่อศึกษาโปรตีนในเซลล์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อตรวจสอบเครื่องหมายภายในไซโตพลาสซึมหรือนิวเคลียส อย่างไรก็ตาม นักวิจัยควรพิจารณาถึงศักยภาพในการหดตัวของเซลล์เมื่อใช้การตรึงเมทานอล

สารยึดติดอื่นๆ (เช่น ฟอร์มาลิน)

ฟอร์มาลินซึ่งเป็นสารละลายของฟอร์มาลดีไฮด์ในน้ำ เป็นสารตรึงอีกชนิดหนึ่งที่ใช้ในโฟลว์ไซโตเมทรี แม้ว่าจะพบได้น้อยกว่า PFA ก็ตาม ฟอร์มาลินมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในเนื้อเยื่อวิทยาและอิมมูโนฮิสโตเคมี ซึ่งจะช่วยรักษาตัวอย่างเนื้อเยื่อเพื่อการวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ แม้ว่าฟอร์มาลินสามารถรักษาโครงสร้างเซลล์ไว้ได้ แต่โดยทั่วไปไม่แนะนำให้ใช้โฟลว์ไซโตเมทรี เว้นแต่จะใช้กับตัวอย่างเนื้อเยื่อคงที่ เนื่องจากฟอร์มาลินอาจรบกวนการเรียงลำดับเซลล์และการใช้งานเรืองแสงบางชนิดได้ การตรึงฟอร์มาลินเหมาะที่สุดสำหรับตัวอย่างเนื้อเยื่อ ไม่ใช่สำหรับเซลล์แต่ละเซลล์

 

ตรึง	ความเข้มข้น	เวลาตรึง	การใช้งานที่แนะนำ
พาราฟอร์มัลดีไฮด์ (PFA)	2-4%	15-30 นาที	เหมาะสำหรับรักษาเครื่องหมายบนผิวเซลล์ ทั่วไปสำหรับอิมมูโนฟีโนไทป์
เอทานอล	70-100%	10-15 นาที	เหมาะสำหรับการวิเคราะห์เนื้อหา DNA และการศึกษาวัฏจักรของเซลล์
เมทานอล	90-100%	10-15 นาที	เหมาะสำหรับการวิเคราะห์โปรตีนในเซลล์ อาจทำให้เซลล์หดตัวได้
ฟอร์มาลิน	10% (ฟอร์มาลดีไฮด์)	แตกต่างกันไป (ขึ้นอยู่กับเนื้อเยื่อ)	โดยทั่วไปใช้สำหรับตัวอย่างเนื้อเยื่อแบบคงที่ ไม่ใช่สำหรับเซลล์แต่ละเซลล์

 

คำแนะนำทีละขั้นตอนในการแก้ไขเซลล์สำหรับ Flow Cytometry

การเตรียมตัวอย่างเซลล์

ก่อนการตรึง จำเป็นต้องแยกเซลล์ออกจากเนื้อเยื่อหรือตัวอย่างเลือดก่อน การหมุนเหวี่ยงเป็นวิธีการทั่วไปที่ใช้ในการรวมเซลล์ให้อยู่ในสารแขวนลอย สิ่งสำคัญคือต้องล้างเซลล์ให้สะอาดเพื่อกำจัดอาหารเลี้ยงเชื้อหรือสิ่งปนเปื้อนที่ตกค้าง ซึ่งอาจรบกวนกระบวนการตรึง

 

1. การแยกเซลล์: ใช้วิธีการแยกมาตรฐาน เช่น การหมุนเหวี่ยง หรือการคัดแยกเซลล์ เพื่อแยกเซลล์ที่สนใจ

2. การล้าง: ล้างเซลล์ด้วยน้ำเกลือที่มีบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) เพื่อกำจัดสิ่งตกค้างและสิ่งปนเปื้อนที่อาจส่งผลต่อกระบวนการตรึง

ขั้นตอนการตรึง

เมื่อเตรียมเซลล์แล้ว ขั้นตอนต่อไปคือการเติมสารตรึงให้กับสารแขวนลอยของเซลล์ สารตรึงที่ใช้กันทั่วไปสำหรับโฟลว์ไซโตเมทรีคือสารละลาย PFA 2-4%

1. เพิ่มสารตรึงลงในสารแขวนลอยของเซลล์ เพื่อให้แน่ใจว่าส่วนผสมเข้ากันดี

2. ฟักเซลล์ด้วยสารตรึงเป็นเวลา 15-30 นาที ที่อุณหภูมิ 2-8°C

3. หลังจากการฟักตัว ให้ล้างเซลล์ด้วย PBS สองครั้งเพื่อขจัดสารยึดเกาะส่วนเกินออก

ขั้นตอนหลังการตรึง

หลังจากการตรึงเซลล์จะต้องได้รับการดูแลอย่างระมัดระวัง หากจำเป็นต้องมีการวิเคราะห์เพิ่มเติม ควรย้อมสีเซลล์ก่อนการวิเคราะห์ หากคุณวางแผนที่จะจัดเก็บเซลล์เพื่อการวิเคราะห์ในอนาคต ให้แขวนเซลล์เหล่านั้นใหม่ในบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 2-8°C หลีกเลี่ยงการปล่อยให้เซลล์อยู่ในสารยึดติดเป็นเวลานาน เนื่องจากการตรึงมากเกินไปอาจทำให้แสงออโตฟลูออเรสเซนต์เพิ่มขึ้นและลดคุณภาพของสัญญาณได้

 

เคล็ดลับเพื่อการตรึงที่เหมาะสมที่สุดใน Flow Cytometry

หลีกเลี่ยงการตรึงมากเกินไป

การตรึงมากเกินไปเกิดขึ้นเมื่อเซลล์สัมผัสกับสารตรึงเป็นเวลานานเกินไป ซึ่งอาจส่งผลให้เกิดการเชื่อมโยงข้ามของโปรตีนในเซลล์มากเกินไป และทำให้คุณภาพของข้อมูลลดลง ซึ่งอาจนำไปสู่การเรืองแสงอัตโนมัติ การจับกับแอนติบอดีลดลง และการวัดโฟลว์ไซโตเมทรีที่ไม่ถูกต้อง ตรวจสอบเวลาการตรึงที่แนะนำสำหรับประเภทเซลล์เฉพาะของคุณและการทดลองเสมอเพื่อหลีกเลี่ยงการตรึงมากเกินไป

เวลาตรึงกับประเภทตัวอย่าง

เวลาตรึงที่เหมาะสมที่สุดอาจแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับประเภทเซลล์และลักษณะของการทดลอง ตัวอย่างเช่น เซลล์ภูมิคุ้มกันอาจต้องใช้เวลาในการตรึงสั้นกว่าตัวอย่างเนื้อเยื่อ ปรับเวลาการตรึงตามความต้องการเฉพาะของประเภทตัวอย่าง สำหรับการวิเคราะห์โปรตีนบนพื้นผิว โดยทั่วไปเวลาการตรึงที่สั้นลง (10-15 นาที) ก็เพียงพอแล้ว สำหรับการย้อมสีภายในเซลล์หรือการวิเคราะห์ DNA อาจต้องใช้เวลาในการตรึงนานขึ้น

การย้อมสีหลังจากการตรึง

หลังจากยึดเซลล์แล้ว การย้อมสีด้วยแอนติบอดีหรือสีย้อมฟลูออเรสเซนต์เป็นขั้นตอนสำคัญในการวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรี สีย้อมฟลูออเรสเซนต์บางชนิด โดยเฉพาะสีย้อมติดกันอาจมีความไวต่อการตรึงและอาจสลายตัวหากเซลล์ถูกตรึงไว้มากเกินไป เพื่อผลลัพธ์การย้อมสีที่ดีที่สุด แนะนำให้ย้อมเซลล์ก่อนการตรึงทุกครั้งที่เป็นไปได้ สิ่งนี้สามารถช่วยป้องกันการเสื่อมสภาพของสีย้อมและรับประกันสัญญาณเรืองแสงที่แข็งแกร่งขึ้น

 

การจัดเก็บเซลล์คงที่สำหรับโฟลว์ไซโตเมทรี

การจัดเก็บระยะสั้น

สำหรับการเก็บรักษาระยะสั้น เซลล์คงที่สามารถเก็บไว้ในตู้เย็นที่อุณหภูมิ 2-8°C วิธีนี้เหมาะอย่างยิ่งเมื่อคุณวางแผนที่จะวิเคราะห์เซลล์ภายในหนึ่งหรือสองวันหลังจากการตรึง เก็บเซลล์คงที่ไว้ในที่มืดเสมอเพื่อป้องกันการฟอกสีด้วยแสง ซึ่งอาจส่งผลต่อสัญญาณฟลูออเรสเซนต์

การจัดเก็บระยะยาว

สำหรับการจัดเก็บระยะยาว เซลล์สามารถถูกแช่แข็งในสื่อการเก็บรักษาด้วยการแช่แข็งได้ สื่อในการเก็บรักษาด้วยการแช่แข็งโดยทั่วไปประกอบด้วยไดเมทิลซัลฟอกไซด์ 10% (DMSO) และซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ (FBS) 90% อย่างไรก็ตาม ยังมีโซลูชันการเก็บรักษาด้วยการแช่แข็งแบบไม่มีซีรั่ม เช่น mFreSR™ หรือ CryoStor™ CS10 อีกด้วย และสามารถใช้เพื่อหลีกเลี่ยงปัญหาที่เกี่ยวข้องกับ FBS เพื่อป้องกันการก่อตัวของผลึกน้ำแข็ง ให้ใช้ตู้แช่แข็งที่มีอัตราควบคุมเพื่อแช่แข็งเซลล์ ซึ่งช่วยรักษาความมีชีวิตของเซลล์และรับประกันการจัดเก็บที่เหมาะสม

 

ข้อผิดพลาดทั่วไปที่ควรหลีกเลี่ยงในการตรึงเซลล์สำหรับ Flow Cytometry

ผลของการตรึงที่ไม่เหมาะสม

การตรึงที่ไม่เหมาะสมอาจนำไปสู่ปัญหาหลายประการ รวมถึงการเรืองแสงอัตโนมัติ การจับกับแอนติบอดีลดลง และความมีชีวิตของเซลล์ที่ไม่ดี ปัญหาเหล่านี้อาจส่งผลกระทบอย่างมากต่อความแม่นยำและความน่าเชื่อถือของผลลัพธ์ของโฟลว์ไซโตเมทรี ตรวจสอบโปรโตคอลการตรึงสำหรับประเภทตัวอย่างเฉพาะของคุณเสมอ และตรวจสอบให้แน่ใจว่าเงื่อนไขการตรึงนั้นเหมาะสมกับประเภทเซลล์และเครื่องหมายที่กำลังวิเคราะห์

การเลือกสารยึดติดที่เหมาะสมสำหรับการใช้งานของคุณ

การเลือกสารตรึงที่เหมาะสมสำหรับการทดสอบโฟลว์ไซโตเมทรีของคุณเป็นสิ่งสำคัญอย่างยิ่งในการได้รับผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้และแม่นยำ สารยึดติดที่แตกต่างกันจะเหมาะกับการใช้งานที่แตกต่างกันมากกว่า ตัวอย่างเช่น PFA มักใช้สำหรับการวิเคราะห์โปรตีนบนพื้นผิว ในขณะที่เอธานอลเหมาะสำหรับการศึกษาเกี่ยวกับ DNA ก่อนที่จะเริ่มการทดลอง ให้ศึกษาสารตรึงที่ดีที่สุดสำหรับการใช้งานเฉพาะของคุณ และปรับเกณฑ์วิธีในการตรึงตามนั้น

 

บทสรุป

การตรึงเซลล์อย่างเหมาะสมถือเป็นสิ่งสำคัญเพื่อให้การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีประสบความสำเร็จ ช่วยรักษาโครงสร้างเซลล์และรับประกันความสมบูรณ์ของโปรตีนและ DNA การปฏิบัติตามโปรโตคอลการตรึงที่เหมาะสมและหลีกเลี่ยงการตรึงมากเกินไป นักวิจัยสามารถเพิ่มความแม่นยำและความน่าเชื่อถือของข้อมูลได้ การเลือกตัวตรึงที่เหมาะสมสำหรับการทดสอบของคุณจะช่วยปรับปรุงคุณภาพโดยรวมของผลลัพธ์ของคุณ การใช้แนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุดเหล่านี้ช่วยให้แน่ใจว่าการวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีของคุณให้ข้อมูลเชิงลึกที่สม่ำเสมอและทำซ้ำได้เกี่ยวกับการทำงานของเซลล์

 

การตรึงเซลล์อย่างเหมาะสมมีบทบาทสำคัญในโฟลว์ไซโตเมทรีและผลิตภัณฑ์จาก HKeybio นำเสนอโซลูชั่นที่เชื่อถือได้ ข้อเสนอเหล่านี้รับประกันผลลัพธ์คุณภาพสูงและได้รับความไว้วางใจจากนักวิจัยทั่วโลกสำหรับการวิเคราะห์เซลล์ที่แม่นยำ

 

คำถามที่พบบ่อย

ถาม: อะไรคือความสำคัญของการตรึงเซลล์ในโฟลไซโตเมทรี?

ตอบ: การตรึงเซลล์มีความสำคัญอย่างยิ่งในโฟลว์ไซโตเมทรี เนื่องจากจะรักษาโครงสร้างเซลล์และรับประกันความสมบูรณ์ของโปรตีนและ DNA เพื่อการวิเคราะห์ที่แม่นยำ

ถาม: เซลล์ควรได้รับการแก้ไขสำหรับโฟลว์ไซโตเมทรีนานแค่ไหน?

ตอบ: โดยทั่วไปเซลล์ควรได้รับการแก้ไขเป็นเวลา 15-30 นาทีด้วยสารละลายพาราฟอร์มัลดีไฮด์ (PFA) 2-4% เพื่อรักษาความสมบูรณ์ของเซลล์

ถาม: ฉันสามารถใช้เอทานอลในการตรึงเซลล์ในโฟลไซโตเมทรีได้หรือไม่

ตอบ: ใช่ การตรึงเอธานอลมักใช้สำหรับการวิเคราะห์ปริมาณ DNA ในโฟลว์ไซโตเมทรี โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการศึกษาวัฏจักรของเซลล์

ถาม: จะเกิดอะไรขึ้นหากเซลล์ได้รับการแก้ไขมากเกินไปในโฟลว์ไซโตเมทรี

ตอบ: การตรึงมากเกินไปอาจทำให้เกิดการเชื่อมโยงข้ามมากเกินไป ส่งผลให้เกิดการเรืองแสงอัตโนมัติและการจับแอนติบอดีที่ไม่ดี ซึ่งอาจส่งผลต่อผลลัพธ์ของโฟลว์ไซโตเมทรี