Bevezetés
Gondolkozott már azon, hogyan Az áramlási citometria ilyen precíz és megbízható sejtelemzést ér el? A pontos eredmények kulcsa a megfelelő sejtrögzítésben rejlik. Az áramlási citometria segítségével a kutatók számos sejtjellemzőt tanulmányozhatnak, a mérettől a fluoreszcencia intenzitásáig. Megfelelő rögzítés nélkül azonban előfordulhat, hogy az adatok nem tükrözik a valódi sejttulajdonságokat. Ebben a cikkben feltárjuk a sejtrögzítés jelentőségét az áramlási citometriában, megvitatjuk a különböző rögzítési módszereket, és megosztunk tippeket az optimális eredmények érdekében.
Mi a sejtrögzítés az áramlási citometriában?
A sejtrögzítés definíciója
A sejtrögzítés egy olyan folyamat, amely stabilizálja és megőrzi a sejteket azáltal, hogy megakadályozza szerkezetükben, funkciójukban és molekuláris összetételükben bekövetkező változásokat. Ezt a folyamatot a fehérjék, lipidek és más sejtkomponensek kémiai térhálósításával érik el, hatékonyan 'lefagyasztva' a sejteket jelenlegi állapotukban. Ez különösen fontos az áramlási citometriában, mert megakadályozza a sejtmarkerek lebomlását vagy a sejtszerkezetek megváltozását az elemzés során. A sejtek rögzítésével a kutatók biztosíthatják, hogy a sejtek jellemzői konzisztensek maradjanak, ami pontos méréseket és megbízható adatokat tesz lehetővé az áramlási citometrikus elemzés során.
Miért fontos a rögzítés?
A megfelelő rögzítés elengedhetetlen, mert megőrzi a sejtfehérjék és nukleinsavak integritását, amelyek kulcsfontosságúak a pontos áramlási citometriás elemzéshez. Ha a sejteket nem rögzítik, szerkezetük és molekuláris markereik idővel lebomlanak vagy megváltozhatnak, ami megbízhatatlan és pontatlan eredményekhez vezethet. A rögzítés kritikus szerepet játszik a sejtek stabilizálásában is a többparaméteres elemzéshez, ami az áramlási citometria egyik legfontosabb erőssége. Lehetővé teszi a kutatók számára, hogy egy kísérletben egyszerre több sejtjellemzőt, például felszíni markereket, intracelluláris fehérjéket és DNS-tartalmat értékeljenek. Megfelelő rögzítés nélkül a kapott adatok következetlenek vagy hiányosak lehetnek, ami a kísérleti eredmények félreértelmezéséhez vezethet.
Az áramlási citometria rögzítési módszereinek típusai
Paraformaldehid (PFA) rögzítés
A paraformaldehid (PFA) az egyik legszélesebb körben használt fixálószer az áramlási citometriában, elsősorban a sejtmorfológia és antigenicitás megőrzésében való hatékonyságának köszönhetően. A fehérjék sejten belüli térhálósításával fejti ki hatását, biztosítva, hogy mind a sejtszerkezet, mind a felszíni fehérjék érintetlenek maradjanak. Ez teszi a PFA-t kiváló választássá a sejtfelszíni markerek megőrzésére, különösen a felszíni fehérje expressziójának elemzésekor immunfenotipizálási kísérletekben.
Ajánlás:
● Koncentráció: általában 2-4% PFA-t használnak az optimális rögzítés érdekében.
● Rögzítési idő: A sejteket PFA-ban 15-30 percig 2-8°C-on kell inkubálni.
● Tárolás: Rögzítés után a sejteket 2-8°C-on kell tárolni a rövid távú tároláshoz. Fontos, hogy a rögzített sejteket ne tároljuk hosszabb ideig, mert ez a marker integritásának elvesztéséhez vezethet.
Fontos elkerülni a túlfixálást, mivel a PFA-nak való hosszan tartó expozíció a sejtek autofluoreszcenciájához vezethet, és megzavarhatja a későbbi festést és elemzést. Mindig a minimálisan szükséges időt használja a rögzítéshez.
Etanol rögzítés
Az etanolos rögzítést általában akkor alkalmazzák, ha az elemzés középpontjában a DNS-tartalom áll, például sejtciklus-vizsgálatoknál. Az etanol egy dehidratáló szer, amely a sejtmembránon keresztül hatolva megőrzi a DNS-t a sejtekben. Ez különösen hasznossá teszi az etanolos rögzítést DNS-alapú vizsgálatokhoz és áramlási citometriás elemzésekhez, ahol a sejtciklus szakaszait vagy a DNS-tartalmat vizsgálják.
Ajánlás:
● Koncentráció: Általában 70-100%-os etanolt használnak.
● Rögzítési idő: Az etanolos rögzítés általában 10-15 percet vesz igénybe az optimális eredmény eléréséhez.
Az etanolos rögzítés ideális a sejtciklus fázisainak megőrzésére, és DNS-kötő festékekkel, például propidium-jodiddal (PI) kombinálva használható a sejtciklus elemzéséhez.
Metanolos rögzítés
A metanol egy másik gyakran használt fixálószer, különösen intracelluláris elemzésekhez. Úgy fejti ki hatását, hogy áthatol a sejtmembránon és stabilizálja a sejt belső struktúráit. Míg a metanol hatékonyan megőrzi a sejtfehérjéket és antigéneket, sejtzsugorodást okozhat, ami befolyásolhatja bizonyos jellemzők értelmezését, például a sejtméretet és a morfológiát.
Ajánlás:
● Koncentráció: Általában 90-100% metanolt használnak.
● Rögzítési idő: 10-15 perc általában elegendő.
A metanolos rögzítést gyakran alkalmazzák intracelluláris fehérjék tanulmányozásakor, különösen a citoplazmában vagy a sejtmagban lévő markerek vizsgálatakor. A kutatóknak azonban figyelembe kell venniük a sejtzsugorodás lehetőségét a metanolos rögzítés alkalmazásakor.
Egyéb fixálószerek (pl. formalin)
A formalin, a formaldehid vizes oldata, az áramlási citometriában használt másik fixálószer, bár kevésbé gyakori, mint a PFA. A formalint széles körben használják a szövettanban és az immunhisztokémiában, ahol hatékonyan megőrzi a szövetmintákat a mikroszkópos elemzéshez. Bár a formalin képes megőrizni a sejtszerkezeteket, általában nem ajánlott áramlási citometriához, kivéve, ha rögzített szövetmintákkal dolgozik, mivel megzavarhatja a sejtválogatást és bizonyos fluoreszcens alkalmazásokat. A formalinos rögzítés a szövetmintákhoz a legalkalmasabb, nem az egyes sejtekhez.
Fixírlakk |
Koncentráció |
Rögzítési idő |
Javasolt felhasználás |
Paraformaldehid (PFA) |
2-4% |
15-30 perc |
Ideális a sejtfelszíni markerek megőrzésére; gyakori az immunfenotipizálásnál |
Etanol |
70-100% |
10-15 perc |
A legjobb DNS-tartalom elemzéshez és sejtciklus-vizsgálatokhoz |
Metanol |
90-100% |
10-15 perc |
Alkalmas intracelluláris fehérje analízisre; sejtzsugorodást okozhat |
Formalin |
10% (formaldehid) |
Változó (szövettől függően) |
Általában rögzített szövetmintákhoz használják, nem egyedi sejtekhez |
Lépésről lépésre útmutató a sejtek rögzítéséhez áramlási citometriához
A sejtminta előkészítése
A rögzítés előtt elengedhetetlen a sejtek izolálása a szövetből vagy vérmintából. A centrifugálás a legáltalánosabb módszer a sejtek szuszpenzióban való koncentrálására. Szintén kritikus a sejtek alapos mosása, hogy eltávolítsunk minden táptalajt vagy maradék szennyeződést, amely megzavarhatja a rögzítési folyamatot.
1. Sejtizolálás: Használjon szabványos izolálási módszereket, például centrifugálást vagy sejtválogatást a kérdéses sejtek elkülönítésére.
2. Mosás: Mossa meg a sejteket foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), hogy eltávolítsa a visszamaradó közegeket és szennyeződéseket, amelyek befolyásolhatják a rögzítési folyamatot.
Rögzítési eljárás
A sejtek előkészítése után a következő lépés a fixálószer hozzáadása a sejtszuszpenzióhoz. Az áramlási citometriához leggyakrabban használt fixálószer a 2-4%-os PFA-oldat.
1. Adja hozzá a fixálót a sejtszuszpenzióhoz, ügyelve arra, hogy jól elkeveredjen.
2. Inkubálja a sejteket a fixálóval 15-30 percig 2-8°C-on.
3. Az inkubálás után a sejteket kétszer mossuk PBS-sel, hogy eltávolítsuk a felesleges fixálószert.
A rögzítés utáni lépések
Rögzítés után a sejteket óvatosan kell kezelni. Ha további elemzésre van szükség, a sejteket az elemzés előtt meg kell festeni. Ha azt tervezi, hogy a sejteket későbbi elemzés céljából tárolja, szuszpendálja újra őket megfelelő pufferben, és tárolja 2-8°C-on. Kerülje el, hogy a sejteket hosszú ideig a fixálóban hagyja, mivel a túlzott rögzítés megnövekedett autofluoreszcenciához és a jelminőség romlásához vezethet.
Tippek az optimális rögzítéshez az áramlási citometriában
A túlzott rögzítés elkerülése
A túlfixálás akkor következik be, ha a sejtek túl sokáig vannak kitéve a fixáló hatásának, ami a sejtfehérjék túlzott keresztkötését eredményezheti, és veszélyeztetheti az adatok minőségét. Ez autofluoreszcenciához, csökkent antitestkötődéshez és pontatlan áramlási citometriás mérésekhez vezethet. Mindig ellenőrizze az adott sejttípushoz javasolt rögzítési időket, és kísérletezzen a túlzott rögzítés elkerülése érdekében.
Rögzítési idő a minta típusától függően
Az optimális rögzítési idő a sejttípustól és a kísérlet jellegétől függően változhat. Például az immunsejtek rövidebb rögzítési időt igényelhetnek, mint a szövetminták. Állítsa be a rögzítési időt a mintatípus speciális igényei szerint. Felületi fehérjeanalízishez általában elegendő rövidebb rögzítési idő (10-15 perc). Intracelluláris festéshez vagy DNS-analízishez hosszabb rögzítési időre lehet szükség.
Festés rögzítés után
A sejtek rögzítése után az antitestekkel vagy fluoreszcens festékekkel történő festés kritikus lépés az áramlási citometriás analízisben. Egyes fluoreszcens festékek, különösen a tandem festékek, érzékenyek lehetnek a fixálásra, és lebomolhatnak, ha a sejtek túlfixáltak. Az optimális festési eredmény érdekében ajánlatos a sejteket fixálás előtt megfesteni, amikor csak lehetséges. Ez segíthet megakadályozni a festék lebomlását és erősebb fluoreszcencia jeleket biztosít.
Rögzített sejtek tárolása áramlási citometriához
Rövid távú tárolás
Rövid ideig tartó tárolás esetén a rögzített cellák hűtőszekrényben 2-8°C-on tárolhatók. Ez ideális, ha azt tervezi, hogy a rögzítést követő egy-két napon belül elemzi a sejteket. A rögzített cellákat mindig sötét helyen tárolja, hogy elkerülje a fényfehérítést, amely befolyásolhatja a fluoreszcens jeleket.
Hosszú távú tárolás
Hosszú távú tároláshoz a sejteket mélyhűtő közegben lefagyaszthatjuk. Egy tipikus mélyhűtési tápközeg 10% dimetil-szulfoxidot (DMSO) és 90% magzati szarvasmarha-szérumot (FBS) tartalmaz. Azonban szérummentes mélyhűtési megoldások, például az mFreSR™ vagy a CryoStor™ CS10 is rendelkezésre állnak, és felhasználhatók az FBS-sel kapcsolatos problémák elkerülésére. A jégkristályok képződésének megelőzése érdekében használjon szabályozott sebességű fagyasztót a sejtek fagyasztásához. Ez segít fenntartani a sejtek életképességét és biztosítja a megfelelő tárolást.
Gyakori buktatók, amelyeket el kell kerülni az áramlási citometria sejtrögzítésében
A nem megfelelő rögzítés hatásai
A nem megfelelő rögzítés számos problémához vezethet, ideértve az autofluoreszcenciát, a csökkent antitestkötést és a rossz sejtéletképességet. Ezek a problémák jelentősen befolyásolhatják az áramlási citometria eredményeinek pontosságát és megbízhatóságát. Mindig ellenőrizze az adott mintatípushoz tartozó rögzítési protokollokat, és győződjön meg arról, hogy a rögzítési feltételek megfelelőek az elemzett sejttípushoz és markerekhez.
A megfelelő rögzítőanyag kiválasztása az alkalmazáshoz
Az áramlási citometriai kísérlethez megfelelő fixáló kiválasztása kulcsfontosságú a megbízható és pontos eredmények eléréséhez. A különböző fixálószerek jobban megfelelnek a különböző alkalmazásoknak. Például a PFA-t általában felületi fehérjeanalízishez használják, míg az etanolt ideális a DNS-alapú vizsgálatokhoz. A kísérlet megkezdése előtt keresse meg az adott alkalmazáshoz legjobb fixálószert, és ennek megfelelően állítsa be a rögzítési protokollt.
Következtetés
A megfelelő sejtrögzítés elengedhetetlen a sikeres áramlási citometriás elemzéshez. Segít megőrizni a sejtszerkezeteket, és biztosítja a fehérjék és a DNS integritását. A megfelelő rögzítési protokollok követésével és a túlzott rögzítés elkerülésével a kutatók javíthatják az adatok pontosságát és megbízhatóságát. A megfelelő fixálószer kiválasztása a kísérlethez javítja az eredmények általános minőségét. Ezen bevált gyakorlatok alkalmazása biztosítja, hogy az áramlási citometriai elemzés következetes, reprodukálható betekintést nyújtson a sejtfunkciókba.
A megfelelő sejtrögzítés kulcsszerepet játszik az áramlási citometriában és az abból származó termékekben A HKeybio megbízható megoldásokat kínál. Kínálatuk kiváló minőségű eredményeket biztosít, és a kutatók világszerte megbíznak bennük a pontos sejtelemzés érdekében.
GYIK
K: Mi a sejtrögzítés jelentősége az áramlási citometriában?
V: A sejtrögzítés kulcsfontosságú az áramlási citometriában, mivel megőrzi a sejtstruktúrákat, és biztosítja a fehérjék és a DNS integritását a pontos elemzéshez.
K: Mennyi ideig kell a sejteket rögzíteni az áramlási citometriához?
V: A sejteket általában 15-30 percig fixálni kell 2-4%-os paraformaldehid (PFA) oldattal a sejtintegritás megőrzése érdekében.
K: Használhatok etanolt sejtrögzítésre áramlási citometriában?
V: Igen, az etanolos rögzítést gyakran használják DNS-tartalom elemzésre az áramlási citometriában, különösen a sejtciklus-vizsgálatoknál.
K: Mi történik, ha a sejtek túlrögzültek az áramlási citometriában?
V: A túlzott rögzítés túlzott keresztkötéseket okozhat, ami autofluoreszcenciához és gyenge antitestkötéshez vezethet, ami befolyásolhatja az áramlási citometria eredményeit.
