Hyrje
A keni menduar ndonjëherë se si citometria e rrjedhës arrin një analizë kaq të saktë dhe të besueshme të qelizave? Çelësi i rezultateve të sakta qëndron në fiksimin e duhur të qelizave. Citometria e rrjedhës i lejon studiuesit të studiojnë një sërë karakteristikash qelizore, nga madhësia deri te intensiteti i fluoreshencës. Megjithatë, pa fiksimin e duhur, të dhënat mund të mos pasqyrojnë vetitë e vërteta celulare. Në këtë artikull, ne do të shqyrtojmë rëndësinë e fiksimit të qelizave në citometrinë e rrjedhës, do të diskutojmë metoda të ndryshme të fiksimit dhe do të ndajmë këshilla për rezultate optimale.
Çfarë është fiksimi i qelizave në citometrinë e rrjedhës?
Përkufizimi i fiksimit të qelizave
Fiksimi i qelizave është një proces që stabilizon dhe ruan qelizat duke parandaluar ndryshimet në strukturën, funksionin dhe përbërjen molekulare të tyre. Ky proces arrihet duke ndërlidhur kimikisht proteinat, lipidet dhe komponentët e tjerë qelizorë, duke 'ngrirë' në mënyrë efektive qelizat në gjendjen e tyre aktuale. Kjo është veçanërisht e rëndësishme në citometrinë e rrjedhës, sepse parandalon degradimin e shënuesve qelizorë ose ndryshimin e strukturave qelizore gjatë analizës. Duke rregulluar qelizat, studiuesit mund të sigurojnë që karakteristikat e qelizave të mbeten të qëndrueshme, gjë që lejon matje të sakta dhe të dhëna të besueshme gjatë analizës së citometrisë së rrjedhës.
Pse fiksimi është i rëndësishëm
Fiksimi i duhur është thelbësor sepse ruan integritetin e proteinave qelizore dhe acideve nukleike, të cilat janë thelbësore për analizën e saktë të citometrisë së rrjedhës. Nëse qelizat nuk fiksohen, struktura e tyre dhe shënuesit molekularë mund të degradohen ose ndryshojnë me kalimin e kohës, duke çuar në rezultate jo të besueshme dhe të pasakta. Fiksimi gjithashtu luan një rol kritik në stabilizimin e qelizave për analizën me shumë parametra, e cila është një nga pikat kryesore të forta të citometrisë së rrjedhës. Ai i lejon studiuesit të vlerësojnë njëkohësisht karakteristika të shumta qelizore, të tilla si shënuesit e sipërfaqes, proteinat ndërqelizore dhe përmbajtjen e ADN-së, në një eksperiment të vetëm. Pa fiksimin e duhur, të dhënat e marra mund të jenë jokonsistente ose jo të plota, duke çuar në keqinterpretim të rezultateve eksperimentale.
Llojet e metodave të fiksimit për citometrinë e rrjedhës
Fiksimi i paraformaldehidit (PFA).
Paraformaldehidi (PFA) është një nga fiksuesit më të përdorur në citometrinë e rrjedhës, kryesisht për shkak të efektivitetit të tij në ruajtjen e morfologjisë dhe antigjenitetit të qelizave. Ajo funksionon duke ndërlidhur proteinat brenda qelizave, duke siguruar që struktura qelizore dhe proteinat sipërfaqësore të mbeten të paprekura. Kjo e bën PFA një zgjedhje të shkëlqyer për ruajtjen e shënuesve të sipërfaqes qelizore, veçanërisht kur analizohet shprehja e proteinave sipërfaqësore në eksperimentet e imunofenotipizimit.
Rekomandim:
● Përqendrimi: 2-4% PFA përdoret zakonisht për fiksim optimal.
● Koha e fiksimit: Qelizat duhet të inkubohen në PFA për 15-30 minuta në 2-8°C.
● Ruajtja: Pas fiksimit, qelizat duhet të ruhen në 2-8°C për ruajtje afatshkurtër. Është e rëndësishme të mos ruhen qelizat fikse për periudha të gjata, pasi kjo mund të çojë në humbjen e integritetit të shënuesit.
Është e rëndësishme të shmanget fiksimi i tepërt, pasi ekspozimi i zgjatur ndaj PFA mund të çojë në autofluoreshencë qelizore dhe të ndërhyjë në ngjyrosjen dhe analizën e mëvonshme. Përdorni gjithmonë kohën minimale të kërkuar për fiksim.
Fiksimi i etanolit
Fiksimi i etanolit përdoret zakonisht kur fokusi i analizës është në përmbajtjen e ADN-së, si për shembull në studimet e ciklit qelizor. Etanoli është një agjent dehidratues që vepron duke depërtuar në membranën qelizore dhe duke ruajtur ADN-në brenda qelizave. Kjo e bën fiksimin e etanolit veçanërisht të dobishëm për analizat e bazuara në ADN dhe analizat e citometrisë së rrjedhës ku po ekzaminohen fazat e ciklit qelizor ose përmbajtja e ADN-së.
Rekomandim:
● Përqendrimi: Në mënyrë tipike, përdoret 70-100% etanol.
● Koha e fiksimit: Fiksimi i etanolit zakonisht kërkon 10-15 minuta për rezultate optimale.
Fiksimi i etanolit është ideal për ruajtjen e fazave të ciklit qelizor dhe mund të përdoret në kombinim me ngjyrat që lidhin ADN-në si jodidi propidium (PI) për analizën e ciklit qelizor.
Fiksimi me metanol
Metanoli është një tjetër fiksues i përdorur zakonisht, veçanërisht për analizat ndërqelizore. Ajo funksionon duke depërtuar në membranën qelizore dhe duke stabilizuar strukturat e brendshme të qelizës. Ndërsa metanoli është efektiv në ruajtjen e proteinave dhe antigjeneve qelizore, ai mund të shkaktojë tkurrje qelizore, e cila mund të ndikojë në interpretimin e veçorive të caktuara, të tilla si madhësia dhe morfologjia e qelizave.
Rekomandim:
● Përqendrimi: Në mënyrë tipike, përdoret 90-100% metanol.
● Koha e fiksimit: 10-15 minuta zakonisht janë të mjaftueshme.
Fiksimi i metanolit përdoret shpesh kur studiohen proteinat ndërqelizore, veçanërisht kur ekzaminohen shënuesit brenda citoplazmës ose bërthamës. Sidoqoftë, studiuesit duhet të marrin në konsideratë mundësinë e tkurrjes së qelizave kur përdorin fiksimin e metanolit.
Fiksues të tjerë (p.sh., Formalina)
Formalina, një zgjidhje e formaldehidit në ujë, është një tjetër fiksues i përdorur në citometrinë e rrjedhës, megjithëse është më pak i zakonshëm se PFA. Formalina përdoret gjerësisht në histologji dhe imunohistokimi, ku ruan në mënyrë efektive mostrat e indeve për analiza mikroskopike. Edhe pse formalina mund të ruajë strukturat qelizore, në përgjithësi nuk rekomandohet për citometrinë e rrjedhës, përveç rasteve kur punoni me mostra të fiksuara të indeve, pasi mund të ndërhyjë në klasifikimin e qelizave dhe disa aplikime fluoreshence. Fiksimi i formalinës është më i përshtatshmi për mostrat e indeve, jo për qelizat individuale.
Fiksues |
Përqendrimi |
Koha e fiksimit |
Përdorimi i rekomanduar |
Paraformaldehidi (PFA) |
2-4% |
15-30 minuta |
Ideale për ruajtjen e shënuesve të sipërfaqes së qelizave; e zakonshme për imunofenotipizimin |
Etanol |
70-100% |
10-15 minuta |
Më e mira për analizën e p�-së dhe studimet e ciklit qelizor |
Metanol |
90-100% |
10-15 minuta |
I përshtatshëm për analizën e proteinave ndërqelizore; mund të shkaktojë tkurrje të qelizave |
Formalina |
10% (formaldehid) |
Ndryshon (varet nga indi) |
Zakonisht përdoret për mostrat e indeve fikse, jo për qelizat individuale |
Udhëzues hap pas hapi për fiksimin e qelizave për citometrinë e rrjedhës
Përgatitja e mostrës së qelizës
Para fiksimit, është thelbësore të izolohen qelizat nga indi ose mostra e gjakut. Centrifugimi është metoda më e zakonshme që përdoret për përqendrimin e qelizave në një suspension. Është gjithashtu kritike që të lahen plotësisht qelizat për të hequr çdo mjedis kulture ose ndotës të mbetur, të cilët mund të ndërhyjnë në procesin e fiksimit.
1. Izolimi i qelizave: Përdorni metoda standarde të izolimit si centrifugimi ose klasifikimi i qelizave për të ndarë qelizat me interes.
2. Larja: Lani qelizat me solucion fiziologjik të izoluar me fosfat (PBS) për të hequr mbetjet e mbetjeve dhe ndotësit që mund të ndikojnë në procesin e fiksimit.
Procedura e fiksimit
Pasi qelizat të përgatiten, hapi tjetër është shtimi i fiksuesit në suspensionin e qelizave. Fiksuesi më i përdorur për citometrinë e rrjedhës është një zgjidhje PFA 2-4%.
1. Shtoni fiksuesin në suspensionin e qelizave, duke u siguruar që të jetë përzier mirë.
2. Inkuboni qelizat me fiksues për 15-30 minuta në 2-8°C.
3. Pas inkubacionit, lani qelizat dy herë me PBS për të hequr fiksuesin e tepërt.
Hapat pas fiksimit
Pas fiksimit, qelizat duhet të trajtohen me kujdes. Nëse nevojiten analiza të mëtejshme, qelizat duhet të ngjyrosen përpara analizës. Nëse planifikoni t'i ruani qelizat për analiza në të ardhmen, risuspendoni ato në një tampon të përshtatshëm dhe ruajini në 2-8°C. Shmangni lënien e qelizave në fiksues për periudha të gjata, pasi fiksimi i tepërt mund të çojë në rritjen e autofluoreshencës dhe uljen e cilësisë së sinjalit.
Këshilla për fiksimin optimal në citometrinë e rrjedhës
Shmangia e Mbifiksimit
Mbifiksimi ndodh kur qelizat ekspozohen ndaj fiksuesit për një kohë të gjatë, gjë që mund të rezultojë në ndërlidhje të tepërt të proteinave qelizore dhe të rrezikojë cilësinë e të dhënave. Kjo mund të çojë në autofluoreshencë, lidhje të reduktuar të antitrupave dhe matje të pasakta të citometrisë së rrjedhës. Kontrolloni gjithmonë kohët e rekomanduara të fiksimit për llojin tuaj specifik të qelizës dhe eksperimentoni për të shmangur fiksimin e tepërt.
Koha e fiksimit kundrejt llojit të mostrës
Koha optimale e fiksimit mund të ndryshojë në varësi të llojit të qelizës dhe natyrës së eksperimentit. Për shembull, qelizat imune mund të kërkojnë kohë më të shkurtra fiksimi sesa mostrat e indeve. Rregulloni kohën e fiksimit bazuar në nevojat specifike të llojit të mostrës. Për analizën e proteinave sipërfaqësore, zakonisht mjafton një kohë më e shkurtër fiksimi (10-15 minuta). Për ngjyrosjen ndërqelizore ose analizën e ADN-së, mund të kërkohet një kohë më e gjatë fiksimi.
Ngjyrosje pas fiksimit
Pas fiksimit të qelizave, ngjyrosja me antitrupa ose ngjyra fluoreshente është një hap kritik në analizën e citometrisë së rrjedhës. Disa ngjyra fluoreshente, veçanërisht ngjyrat tandem, mund të jenë të ndjeshme ndaj fiksimit dhe mund të degradojnë nëse qelizat janë të fiksuara tepër. Për rezultate optimale të ngjyrosjes, rekomandohet që qelizat të njollosen përpara fiksimit sa herë që është e mundur. Kjo mund të ndihmojë në parandalimin e degradimit të bojës dhe të sigurojë sinjale më të forta fluoreshence.
Ruajtja e qelizave fikse për citometrinë e rrjedhës
Ruajtja Afatshkurtër
Për ruajtje afatshkurtër, qelizat fikse mund të ruhen në frigorifer në 2-8°C. Kjo është ideale kur planifikoni të analizoni qelizat brenda një ose dy ditësh pas fiksimit. Gjithmonë ruani qelizat fikse në errësirë për të parandaluar zbardhjen e fotove, e cila mund të ndikojë në sinjalet fluoreshente.
Ruajtja afatgjatë
Për ruajtje afatgjatë, qelizat mund të ngrihen në mjedise krioprezervuese. Një medium tipik krioprezervues përbëhet nga 10% dimetil sulfoksid (DMSO) dhe 90% serum fetusi i gjedhit (FBS). Megjithatë, zgjidhjet e kriopruajtjes pa serum si mFreSR™ ose CryoStor™ CS10 janë gjithashtu të disponueshme dhe mund të përdoren për të shmangur problemet që lidhen me FBS. Për të parandaluar formimin e kristaleve të akullit, përdorni një ngrirës me shpejtësi të kontrolluar për të ngrirëmon në ruajtjen e qëndrueshmërisë së qelizave dhe siguron ruajtjen e duhur.
Grackat e zakonshme që duhen shmangur në fiksimin e qelizave për citometrinë e rrjedhës
Efektet e fiksimit jo të duhur
Fiksimi i gabuar mund të çojë në disa probleme, duke përfshirë autofluoreshencën, lidhjen e reduktuar të antitrupave dhe qëndrueshmërinë e dobët të qelizave. Këto çështje mund të ndikojnë ndjeshëm në saktësinë dhe besueshmërinë e rezultateve të citometrisë së rrjedhës. Gjithmonë verifikoni protokollet e fiksimit për llojin tuaj specifik të mostrës dhe sigurohuni që kushtet e fiksimit të jenë të përshtatshme për llojin e qelizës dhe shënuesit që analizohen.
Zgjedhja e fiksuesit të duhur për aplikacionin tuaj
Zgjedhja e fiksuesit të përshtatshëm për eksperimentin tuaj të citometrisë rrjedhëse është thelbësore për marrjen e rezultateve të besueshme dhe të sakta. Fiksues të ndryshëm janë më të përshtatshëm për aplikime të ndryshme. Për shembull, PFA përdoret zakonisht për analizën e proteinave sipërfaqësore, ndërsa etanoli është ideal për studime të bazuara në ADN. Përpara se të filloni eksperimentin, kërkoni fiksuesin më të mirë për aplikimin tuaj specifik dhe rregulloni protokollin e fiksimit në përputhje me rrethanat.
konkluzioni
Fiksimi i duhur i qelizave është thelbësor për arritjen e një analize të suksesshme të citometrisë së rrjedhës. Ndihmon në ruajtjen e strukturave qelizore dhe siguron integritetin e proteinave dhe ADN-së. Duke ndjekur protokollet e duhura të fiksimit dhe duke shmangur fiksimin e tepërt, studiuesit mund të rrisin saktësinë dhe besueshmërinë e të dhënave. Zgjedhja e fiksuesit të përshtatshëm për eksperimentin tuaj përmirëson cilësinë e përgjithshme të rezultateve tuaja. Zbatimi i këtyre praktikave më të mira siguron që analiza juaj e citometrisë së rrjedhës ofron njohuri të qëndrueshme dhe të riprodhueshme për funksionet qelizore.
Fiksimi i duhur i qelizave luan një rol kyç në citometrinë e rrjedhës dhe produktet nga HKeybio ofron zgjidhje të besueshme. Ofertat e tyre sigurojnë rezultate me cilësi të lartë dhe u besohen studiuesve në mbarë botën për analizën e saktë të qelizave.
FAQ
Pyetje: Cila është rëndësia e fiksimit të qelizave në citometrinë e rrjedhës?
Përgjigje: Fiksimi i qelizave është thelbësor në citometrinë e rrjedhës pasi ruan strukturat qelizore dhe siguron integritetin e proteinave dhe ADN-së për analiza të sakta.
Pyetje: Sa kohë duhet të fiksohen qelizat për citometrinë e rrjedhës?
Përgjigje: Qelizat zakonisht duhet të fiksohen për 15-30 minuta me një zgjidhje 2-4% paraformaldehid (PFA) për të ruajtur integritetin qelizor.
Pyetje: A mund të përdor etanolin për fiksimin e qelizave në citometrinë e rrjedhës?
Përgjigje: Po, fiksimi i etanolit përdoret zakonisht për analizën e përmbajtjes së ADN-së në citometrinë e rrjedhës, veçanërisht për studimet e ciklit qelizor.
Pyetje: Çfarë ndodh nëse qelizat fiksohen tepër në citometrinë e rrjedhës?
Përgjigje: Mbifiksimi mund të shkaktojë ndërlidhje të tepërt, duke çuar në autofluoreshencë dhe lidhje të dobët të antitrupave, gjë që mund të ndikojë në rezultatet e citometrisë së rrjedhës.
