Introducción
¿Alguna vez te has preguntado cómo ¿ La citometría de flujo logra un análisis celular tan preciso y confiable? La clave para obtener resultados precisos radica en la fijación celular adecuada. La citometría de flujo permite a los investigadores estudiar una variedad de características celulares, desde el tamaño hasta la intensidad de la fluorescencia. Sin embargo, sin una fijación adecuada, es posible que los datos no reflejen las verdaderas propiedades celulares. En este artículo, exploraremos la importancia de la fijación celular en la citometría de flujo, analizaremos diferentes métodos de fijación y compartiremos consejos para obtener resultados óptimos.
¿Qué es la fijación celular en citometría de flujo?
Definición de fijación celular
La fijación celular es un proceso que estabiliza y preserva las células evitando cambios en su estructura, función y composición molecular. Este proceso se logra entrecruzando químicamente proteínas, lípidos y otros componentes celulares, 'congelando' efectivamente las células en su estado actual. Esto es particularmente importante en citometría de flujo porque previene la degradación de marcadores celulares o la alteración de estructuras celulares durante el análisis. Al reparar las células, los investigadores pueden garantizar que las características de las células sigan siendo consistentes, lo que permite mediciones precisas y datos confiables durante el análisis de citometría de flujo.
Por qué la fijación es importante
La fijación adecuada es esencial porque mantiene la integridad de las proteínas celulares y los ácidos nucleicos, que son cruciales para un análisis preciso de citometría de flujo. Si las células no se fijan, su estructura y marcadores moleculares pueden degradarse o cambiar con el tiempo, lo que genera resultados poco fiables e inexactos. La fijación también desempeña un papel fundamental en la estabilización de las células para el análisis multiparamétrico, que es uno de los puntos fuertes de la citometría de flujo. Permite a los investigadores evaluar simultáneamente múltiples características celulares, como marcadores de superficie, proteínas intracelulares y contenido de ADN, en un solo experimento. Sin una fijación adecuada, los datos obtenidos podrían ser inconsistentes o incompletos, lo que llevaría a una interpretación errónea de los resultados experimentales.
Tipos de métodos de fijación para citometría de flujo
Fijación de paraformaldehído (PFA)
El paraformaldehído (PFA) es uno de los fijadores más utilizados en citometría de flujo, principalmente debido a su eficacia para preservar la morfología y antigenicidad celular. Funciona entrecruzando proteínas dentro de las células, asegurando que tanto la estructura celular como las proteínas de la superficie permanezcan intactas. Esto convierte a la PFA en una excelente opción para preservar los marcadores de la superficie celular, especialmente cuando se analiza la expresión de proteínas de la superficie en experimentos de inmunofenotipado.
Recomendación:
● Concentración: 2-4% de PFA se usa comúnmente para una fijación óptima.
● Tiempo de fijación: Las células se deben incubar en PFA durante 15 a 30 minutos a 2-8°C.
● Almacenamiento: Después de la fijación, las células deben almacenarse a 2-8°C para un almacenamiento a corto plazo. Es importante no almacenar células fijas durante períodos prolongados, ya que esto puede provocar la pérdida de la integridad del marcador.
Es importante evitar la fijación excesiva, ya que la exposición prolongada a PFA puede provocar autofluorescencia celular e interferir con la tinción y el análisis posteriores. Utilice siempre el tiempo mínimo necesario para la fijación.
Fijación de etanol
La fijación con etanol se utiliza comúnmente cuando el análisis se centra en el contenido de ADN, como en los estudios del ciclo celular. El etanol es un agente deshidratante que actúa penetrando la membrana celular y preservando el ADN dentro de las células. Esto hace que la fijación de etanol sea particularmente útil para ensayos basados en ADN y análisis de citometría de flujo donde se examinan las etapas del ciclo celular o el contenido de ADN.
Recomendación:
● Concentración: Normalmente se utiliza etanol entre 70 y 100 %.
● Tiempo de fijación: la fijación con etanol normalmente requiere de 10 a 15 minutos para obtener resultados óptimos.
La fijación con etanol es ideal para preservar las fases del ciclo celular y se puede utilizar en combinación con colorantes de unión al ADN, como el yoduro de propidio (PI), para el análisis del ciclo celular.
Fijación de metanol
El metanol es otro fijador comúnmente utilizado, especialmente para análisis intracelulares. Actúa penetrando la membrana celular y estabilizando las estructuras internas de la célula. Si bien el metanol es eficaz para preservar proteínas y antígenos celulares, puede provocar una contracción celular, lo que podría afectar la interpretación de ciertas características, como el tamaño y la morfología de las células.
Recomendación:
● Concentración: Normalmente se utiliza entre 90 y 100 % de metanol.
● Tiempo de fijación: normalmente es suficiente entre 10 y 15 minutos.
La fijación de metanol se emplea a menudo cuando se estudian proteínas intracelulares, especialmente cuando se examinan marcadores dentro del citoplasma o el núcleo. Sin embargo, los investigadores deberían considerar el potencial de contracción celular cuando se utiliza la fijación con metanol.
Otros fijadores (p. ej., formalina)
La formalina, una solución de formaldehído en agua, es otro fijador utilizado en citometría de flujo, aunque es menos común que el PFA. La formalina se usa ampliamente en histología e inmunohistoquímica, donde conserva eficazmente muestras de tejido para análisis microscópicos. Aunque la formalina puede preservar las estructuras celulares, generalmente no se recomienda para citometría de flujo a menos que se trabaje con muestras de tejido fijadas, ya que puede interferir con la clasificación de células y algunas aplicaciones de fluorescencia. La fijación con formalina es más adecuada para muestras de tejido, no para células individuales.
Fijador |
Concentración |
Tiempo de fijación |
Uso recomendado |
Paraformaldehído (PFA) |
2-4% |
15-30 minutos |
Ideal para preservar marcadores de superficie celular; común para inmunofenotipado |
Etanol |
70-100% |
10-15 minutos |
Lo mejor para análisis de contenido de ADN y estudios del ciclo celular. |
Metanol |
90-100% |
10-15 minutos |
Adecuado para análisis de proteínas intracelulares; puede causar encogimiento celular |
Formalina |
10% (formaldehído) |
Varía (depende del tejido) |
Generalmente se utiliza para muestras de tejido fijadas, no para células individuales. |
Guía paso a paso para la fijación de células para citometría de flujo
Preparar la muestra celular
Antes de la fijación, es fundamental aislar las células del tejido o de la muestra de sangre. La centrifugación es el método más común utilizado para concentrar células en una suspensión. También es fundamental lavar bien las células para eliminar cualquier medio de cultivo o contaminantes residuales que puedan interferir con el proceso de fijación.
1. Aislamiento celular: utilice métodos de aislamiento estándar, como centrifugación o clasificación celular, para separar las células de interés.
2. Lavado: Lave las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar los medios residuales y los contaminantes que podrían afectar el proceso de fijación.
Procedimiento de fijación
Una vez preparadas las células, el siguiente paso es añadir el fijador a la suspensión celular. El fijador más utilizado para la citometría de flujo es una solución de PFA al 2-4%.
1. Agregue el fijador a la suspensión celular, asegurándose de que esté bien mezclado.
2. Incubar las células con el fijador durante 15-30 minutos a 2-8°C.
3. Después de la incubación, lave las células dos veces con PBS para eliminar el exceso de fijador.
Pasos posteriores a la fijación
Después de la fijación, las células deben manipularse con cuidado. Si se necesitan más análisis, las células deben teñirse antes del análisis. Si planea almacenar las células para análisis futuros, resuspéndalas en un tampón adecuado y guárdelas a 2-8 °C. Evite dejar células en el fijador durante períodos prolongados, ya que una fijación excesiva puede provocar un aumento de la autofluorescencia y una reducción de la calidad de la señal.
Consejos para una fijación óptima en citometría de flujo
Evitar la fijación excesiva
La sobrefijación se produce cuando las células están expuestas al fijador durante demasiado tiempo, lo que puede provocar una reticulación excesiva de las proteínas celulares y comprometer la calidad de los datos. Esto puede provocar autofluorescencia, reducción de la unión de anticuerpos y mediciones de citometría de flujo inexactas. Compruebe siempre los tiempos de fijación recomendados para su tipo de célula específico y experimente para evitar una fijación excesiva.
Tiempo de fijación versus tipo de muestra
El tiempo de fijación óptimo puede variar según el tipo de célula y la naturaleza del experimento. Por ejemplo, las células inmunitarias pueden requerir tiempos de fijación más cortos que las muestras de tejido. Ajuste el tiempo de fijación en función de las necesidades específicas del tipo de muestra. Para el análisis de proteínas de superficie, suele ser suficiente un tiempo de fijación más corto (10-15 minutos). Para la tinción intracelular o el análisis de ADN, es posible que se requiera un tiempo de fijación más prolongado.
Tinción después de la fijación
Después de fijar las células, la tinción con anticuerpos o tintes fluorescentes es un paso fundamental en el análisis de citometría de flujo. Algunos tintes fluorescentes, en particular los tintes en tándem, pueden ser sensibles a la fijación y degradarse si las células se fijan demasiado. Para obtener resultados de tinción óptimos, se recomienda teñir las células antes de la fijación siempre que sea posible. Esto puede ayudar a prevenir la degradación del tinte y garantizar señales de fluorescencia más fuertes.
Almacenamiento de celdas fijas para citometría de flujo
Almacenamiento a corto plazo
Para almacenamiento a corto plazo, las células fijas se pueden almacenar en el refrigerador a 2-8°C. Esto es ideal cuando planea analizar las células uno o dos días después de la fijación. Guarde siempre las células fijas en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo, que puede afectar las señales fluorescentes.
Almacenamiento a largo plazo
Para el almacenamiento a largo plazo, las células se pueden congelar en medios de criopreservación. Un medio de criopreservación típico consta de un 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) y un 90% de suero bovino fetal (FBS). Sin embargo, también están disponibles soluciones de criopreservación sin suero como mFreSR™ o CryoStor™ CS10 y pueden usarse para evitar problemas asociados con FBS. Para evitar la formación de cristales de hielo, use un congelador de velocidad controlada para congelar las células. Esto ayuda a mantener la viabilidad celular y garantiza un almacenamiento adecuado.
Errores comunes que se deben evitar en la fijación celular para citometría de flujo
Efectos de una fijación inadecuada
Una fijación inadecuada puede provocar varios problemas, incluida la autofluorescencia, la reducción de la unión de anticuerpos y la escasa viabilidad celular. Estos problemas pueden afectar significativamente la precisión y confiabilidad de los resultados de la citometría de flujo. Verifique siempre los protocolos de fijación para su tipo de muestra específico y asegúrese de que las condiciones de fijación sean apropiadas para el tipo de célula y los marcadores que se analizan.
Elegir el fijador adecuado para su aplicación
Elegir el fijador adecuado para su experimento de citometría de flujo es crucial para obtener resultados confiables y precisos. Diferentes fijadores son más adecuados para diferentes aplicaciones. Por ejemplo, el PFA se utiliza habitualmente para el análisis de proteínas de superficie, mientras que el etanol es ideal para estudios basados en el ADN. Antes de comenzar el experimento, investigue cuál es el mejor fijador para su aplicación específica y ajuste el protocolo de fijación en consecuencia.
Conclusión
La fijación celular adecuada es esencial para lograr un análisis exitoso de citometría de flujo. Ayuda a preservar las estructuras celulares y asegura la integridad de las proteínas y el ADN. Siguiendo protocolos de fijación adecuados y evitando la fijación excesiva, los investigadores pueden mejorar la precisión y confiabilidad de los datos. Seleccionar el fijador adecuado para su experimento mejora la calidad general de sus resultados. La implementación de estas mejores prácticas garantiza que su análisis de citometría de flujo proporcione información consistente y reproducible sobre las funciones celulares.
La fijación celular adecuada juega un papel clave en la citometría de flujo y los productos de HKeybio ofrece soluciones confiables. Sus ofertas garantizan resultados de alta calidad y cuentan con la confianza de investigadores de todo el mundo para realizar análisis celulares precisos.
Preguntas frecuentes
P: ¿Cuál es la importancia de la fijación celular en la citometría de flujo?
R: La fijación celular es crucial en la citometría de flujo, ya que preserva las estructuras celulares y garantiza la integridad de las proteínas y el ADN para un análisis preciso.
P: ¿Cuánto tiempo se deben fijar las células para la citometría de flujo?
R: Por lo general, las células deben fijarse durante 15 a 30 minutos con una solución de paraformaldehído (PFA) al 2-4 % para mantener la integridad celular.
P: ¿Puedo utilizar etanol para la fijación celular en citometría de flujo?
R: Sí, la fijación con etanol se usa comúnmente para el análisis del contenido de ADN en citometría de flujo, especialmente para estudios del ciclo celular.
P: ¿Qué sucede si las células se fijan demasiado en la citometría de flujo?
R: La fijación excesiva puede provocar una reticulación excesiva, lo que provoca autofluorescencia y una unión deficiente de los anticuerpos, lo que puede afectar los resultados de la citometría de flujo.
