چگونه سلول ها را برای فلوسیتومتری ثابت کنیم

مقدمه

آیا تا به حال فکر کرده اید که چگونه فلوسایتومتری به چنین تجزیه و تحلیل سلولی دقیق و قابل اعتمادی دست می یابد؟ کلید رسیدن به نتایج دقیق در تثبیت صحیح سلول ها نهفته است. فلوسیتومتری به محققان اجازه می دهد تا انواع مختلفی از ویژگی های سلولی، از اندازه تا شدت فلورسانس را مطالعه کنند. با این حال، بدون تثبیت مناسب، داده ها ممکن است ویژگی های سلولی واقعی را منعکس نکنند. در این مقاله، اهمیت تثبیت سلولی در فلوسیتومتری را بررسی می‌کنیم، روش‌های مختلف تثبیت را مورد بحث قرار می‌دهیم و نکاتی را برای نتایج بهینه به اشتراک می‌گذاریم.

 

تثبیت سلولی در فلوسایتومتری چیست؟

تعریف تثبیت سلولی

تثبیت سلولی فرآیندی است که با جلوگیری از تغییر در ساختار، عملکرد و ترکیب مولکولی سلول ها را تثبیت و حفظ می کند. این فرآیند با اتصال شیمیایی پروتئین‌ها، لیپیدها و سایر اجزای سلولی به دست می‌آید که به طور موثر سلول‌ها را در حالت فعلی «انجماد» می‌کند. این امر به ویژه در فلوسیتومتری مهم است زیرا از تخریب نشانگرهای سلولی یا تغییر ساختارهای سلولی در طول تجزیه و تحلیل جلوگیری می کند. با تثبیت سلول‌ها، محققان می‌توانند اطمینان حاصل کنند که ویژگی‌های سلول‌ها ثابت می‌مانند، که امکان اندازه‌گیری دقیق و داده‌های قابل اعتماد را در طول آنالیز فلوسیتومتری فراهم می‌کند.

چرا تثبیت مهم است

تثبیت مناسب ضروری است زیرا یکپارچگی پروتئین های سلولی و اسیدهای نوکلئیک را حفظ می کند، که برای تجزیه و تحلیل دقیق فلوسیتومتری بسیار مهم هستند. اگر سلول ها ثابت نباشند، ساختار و نشانگرهای مولکولی آنها ممکن است در طول زمان تخریب یا تغییر کنند که منجر به نتایج غیر قابل اعتماد و نادرست می شود. تثبیت همچنین نقش مهمی در تثبیت سلول ها برای تجزیه و تحلیل چند پارامتری دارد که یکی از نقاط قوت کلیدی فلوسیتومتری است. این به محققان اجازه می دهد تا به طور همزمان چندین ویژگی سلولی مانند نشانگرهای سطحی، پروتئین های درون سلولی و محتوای DNA را در یک آزمایش واحد ارزیابی کنند. بدون تثبیت مناسب، داده‌های به‌دست‌آمده می‌تواند ناسازگار یا ناقص باشد، که منجر به تفسیر نادرست نتایج تجربی می‌شود.

 

انواع روش های تثبیت برای فلوسایتومتری

تثبیت پارافورمالدئید (PFA).

پارافورمالدئید (PFA) یکی از پرکاربردترین فیکساتورها در فلوسیتومتری است که در درجه اول به دلیل اثربخشی آن در حفظ مورفولوژی و آنتی ژنی سلولی است. این کار با اتصال متقابل پروتئین ها در سلول ها، تضمین می کند که ساختار سلولی و پروتئین های سطحی دست نخورده باقی می مانند. این باعث می شود PFA یک انتخاب عالی برای حفظ نشانگرهای سطح سلولی، به ویژه هنگام تجزیه و تحلیل بیان پروتئین سطحی در آزمایش های ایمونوفنوتایپینگ باشد.

توصیه:

● غلظت: 2-4٪ PFA معمولا برای تثبیت بهینه استفاده می شود.

● زمان تثبیت: سلول ها باید در PFA به مدت 15-30 دقیقه در دمای 2-8 درجه سانتی گراد انکوبه شوند.

● ذخیره سازی: پس از تثبیت، سلول ها باید برای نگهداری کوتاه مدت در دمای 2-8 درجه سانتیگراد نگهداری شوند. مهم است که سلول های ثابت را برای مدت طولانی ذخیره نکنید، زیرا ممکن است منجر به از دست دادن یکپارچگی نشانگر شود.

اجتناب از تثبیت بیش از حد مهم است، زیرا قرار گرفتن در معرض طولانی مدت با PFA می تواند منجر به اتوفلورسانس سلولی شود و در رنگ آمیزی و تجزیه و تحلیل بعدی تداخل ایجاد کند. همیشه از حداقل زمان لازم برای تثبیت استفاده کنید.

تثبیت اتانول

تثبیت اتانول معمولاً زمانی استفاده می شود که تمرکز تجزیه و تحلیل بر روی محتوای DNA باشد، مانند مطالعات چرخه سلولی. اتانول یک عامل آب‌گیری است که با نفوذ به غشای سلولی و حفظ DNA درون سلول‌ها عمل می‌کند. این امر تثبیت اتانول را به ویژه برای سنجش های مبتنی بر DNA و آنالیزهای فلوسیتومتری که مراحل چرخه سلولی یا محتوای DNA در حال بررسی هستند، مفید می کند.

توصیه:

● غلظت: به طور معمول اتانول 70-100% استفاده می شود.

● زمان تثبیت: تثبیت اتانول معمولاً به 10-15 دقیقه برای نتایج مطلوب نیاز دارد.

تثبیت اتانول برای حفظ مراحل چرخه سلولی ایده آل است و می توان از آن در ترکیب با رنگ های متصل شونده به DNA مانند پروپیدیوم یدید (PI) برای تجزیه و تحلیل چرخه سلولی استفاده کرد.

تثبیت متانول

متانول یکی دیگر از تثبیت‌کننده‌های رایج است، به ویژه برای آنالیزهای درون سلولی. با نفوذ به غشای سلولی و تثبیت ساختارهای داخلی سلول عمل می کند. در حالی که متانول در حفظ پروتئین ها و آنتی ژن های سلولی موثر است، می تواند باعث انقباض سلولی شود که ممکن است بر تفسیر برخی ویژگی ها مانند اندازه و مورفولوژی سلول تأثیر بگذارد.

توصیه:

● غلظت: به طور معمول، متانول 90-100٪ استفاده می شود.

● زمان تثبیت: معمولاً 10-15 دقیقه کافی است.

تثبیت متانول اغلب هنگام مطالعه پروتئین های داخل سلولی، به ویژه هنگام بررسی نشانگرهای داخل سیتوپلاسم یا هسته، استفاده می شود. با این حال، محققان باید پتانسیل انقباض سلولی را هنگام استفاده از تثبیت متانول در نظر بگیرند.

سایر فیکساتورها (مانند فرمالین)

فرمالین، محلول فرمالدئید در آب، تثبیت کننده دیگری است که در فلوسیتومتری استفاده می شود، اگرچه نسبت به PFA کمتر رایج است. فرمالین به طور گسترده در بافت شناسی و ایمونوهیستوشیمی استفاده می شود، جایی که به طور موثر نمونه های بافت را برای تجزیه و تحلیل میکروسکوپی حفظ می کند. اگرچه فرمالین می‌تواند ساختارهای سلولی را حفظ کند، اما معمولاً برای فلوسیتومتری توصیه نمی‌شود مگر اینکه با نمونه‌های بافت ثابت کار کنید، زیرا می‌تواند در مرتب‌سازی سلولی و برخی کاربردهای فلورسانس اختلال ایجاد کند. تثبیت فرمالین برای نمونه های بافتی مناسب است، نه برای سلول های منفرد.

 

ثابت کننده	تمرکز	زمان تثبیت	استفاده توصیه شده
پارافورمالدئید (PFA)	2-4٪	15-30 دقیقه	ایده آل برای حفظ نشانگرهای سطح سلولی؛ رایج برای ایمونوفنوتایپینگ
اتانول	70-100٪	10-15 دقیقه	بهترین برای تجزیه و تحلیل محتوای DNA و مطالعات چرخه سلولی
متانول	90-100٪	10-15 دقیقه	مناسب برای آنالیز پروتئین درون سلولی؛ ممکن است باعث کوچک شدن سلول شود
فرمالین	10٪ (فرمالدئید)	متفاوت است (بستگی به بافت دارد)	معمولا برای نمونه های بافت ثابت استفاده می شود، نه برای سلول های منفرد

 

راهنمای گام به گام برای تثبیت سلول ها برای فلوسیتومتری

آماده سازی نمونه سلولی

قبل از تثبیت، جداسازی سلول ها از بافت یا نمونه خون ضروری است. سانتریفیوژ رایج ترین روشی است که برای تغلیظ سلول ها در سوسپانسیون استفاده می شود. همچنین شستشوی کامل سلول ها برای حذف هر گونه محیط کشت یا آلاینده های باقیمانده که می تواند در روند تثبیت اختلال ایجاد کند، بسیار مهم است.

 

1. جداسازی سلول: از روش های استاندارد جداسازی مانند سانتریفیوژ یا مرتب سازی سلولی برای جداسازی سلول های مورد نظر استفاده کنید.

2. شستشو: سلول ها را با سالین بافر فسفات (PBS) بشویید تا مواد باقیمانده و آلاینده هایی که می توانند بر روند تثبیت اثر بگذارند حذف شوند.

رویه تثبیت

پس از آماده شدن سلول ها، مرحله بعدی افزودن فیکساتور به سوسپانسیون سلولی است. رایج ترین فیکساتور مورد استفاده برای فلوسیتومتری محلول 2-4٪ PFA است.

1. فیکساتور را به سوسپانسیون سلولی اضافه کنید و مطمئن شوید که به خوبی مخلوط شده است.

2. سلول ها را با فیکساتور به مدت 30-15 دقیقه در دمای 8-2 درجه سانتی گراد انکوبه کنید.

3. پس از انکوباسیون، سلول ها را دو بار با PBS بشویید تا فیکساتور اضافی خارج شود.

مراحل پس از تثبیت

پس از تثبیت، سلول ها باید با دقت کار شوند. در صورت نیاز به تجزیه و تحلیل بیشتر، سلول ها باید قبل از تجزیه و تحلیل رنگ آمیزی شوند. اگر قصد دارید سلول ها را برای تجزیه و تحلیل آینده ذخیره کنید، آنها را مجدداً در یک بافر مناسب معلق کنید و در دمای 2-8 درجه سانتی گراد نگهداری کنید. از ماندن سلول ها در فیکساتور برای مدت طولانی خودداری کنید، زیرا تثبیت بیش از حد می تواند منجر به افزایش اتوفلورسانس و کاهش کیفیت سیگنال شود.

 

نکاتی برای تثبیت بهینه در فلوسایتومتری

اجتناب از تثبیت بیش از حد

تثبیت بیش از حد زمانی اتفاق می‌افتد که سلول‌ها برای مدت طولانی در معرض فیکساتور قرار می‌گیرند، که می‌تواند منجر به پیوند متقابل بیش از حد پروتئین‌های سلولی شود و کیفیت داده‌ها را به خطر بیندازد. این می تواند منجر به اتوفلورسانس، کاهش اتصال آنتی بادی، و اندازه گیری های فلوسیتومتری نادرست شود. همیشه زمان های تثبیت توصیه شده را برای نوع سلول خاص خود بررسی کنید و آزمایش کنید تا از تثبیت بیش از حد جلوگیری کنید.

زمان تثبیت در مقابل نوع نمونه

زمان تثبیت بهینه ممکن است بسته به نوع سلول و ماهیت آزمایش متفاوت باشد. برای مثال، سلول‌های ایمنی ممکن است به زمان‌های تثبیت کوتاه‌تری نسبت به نمونه‌های بافتی نیاز داشته باشند. زمان تثبیت را بر اساس نیازهای خاص نوع نمونه تنظیم کنید. برای آنالیز پروتئین سطحی، معمولاً زمان تثبیت کوتاهتر (10-15 دقیقه) کافی است. برای رنگ آمیزی داخل سلولی یا آنالیز DNA، ممکن است به زمان تثبیت طولانی تری نیاز باشد.

رنگ آمیزی پس از تثبیت

پس از تثبیت سلول ها، رنگ آمیزی با آنتی بادی ها یا رنگ های فلورسنت یک مرحله حیاتی در آنالیز فلوسیتومتری است. برخی از رنگ‌های فلورسنت، به‌ویژه رنگ‌های پشت سر هم، می‌توانند به تثبیت حساس باشند و در صورت ثابت ماندن بیش از حد سلول‌ها ممکن است تخریب شوند. این می تواند به جلوگیری از تخریب رنگ و تضمین سیگنال های فلورسانس قوی تر کمک کند.

 

ذخیره سازی سلول های ثابت برای فلوسیتومتری

ذخیره سازی کوتاه مدت

برای نگهداری کوتاه مدت، سلول های ثابت را می توان در یخچال در دمای 8-2 درجه سانتی گراد نگهداری کرد. این زمانی ایده آل است که قصد دارید سلول ها را ظرف یک یا دو روز پس از تثبیت آنالیز کنید. همیشه سلول های ثابت را در تاریکی ذخیره کنید تا از سفید شدن نور، که می تواند بر سیگنال های فلورسنت تأثیر بگذارد، جلوگیری کنید.

ذخیره سازی طولانی مدت

برای نگهداری طولانی مدت، سلول ها را می توان در محیط های انجماد منجمد کرد. یک محیط انجماد معمولی شامل 10٪ دی متیل سولفوکسید (DMSO) و 90٪ سرم جنین گاوی (FBS) است. با این حال، محلول‌های انجماد بدون سرم مانند mFreSR™ یا CryoStor™ CS10 نیز موجود است و می‌توان از آنها برای جلوگیری از مشکلات مرتبط با FBS استفاده کرد. برای جلوگیری از تشکیل کریستال یخ، از فریزر با نرخ کنترل‌شده برای انجماد سلول‌ها استفاده کنید. این به حفظ حیات سلولی کمک می کند و ذخیره سازی مناسب را تضمین می کند.

 

مشکلات متداول در تثبیت سلولی برای فلوسایتومتری

اثرات تثبیت نامناسب

تثبیت نامناسب می تواند منجر به مشکلات متعددی شود، از جمله اتوفلورسانس، کاهش اتصال آنتی بادی و زنده ماندن ضعیف سلول. این مسائل می تواند به طور قابل توجهی بر دقت و قابلیت اطمینان نتایج فلوسیتومتری تأثیر بگذارد. همیشه پروتکل های تثبیت را برای نوع نمونه خاص خود تأیید کنید و مطمئن شوید که شرایط تثبیت برای نوع سلول و نشانگرهای مورد تجزیه و تحلیل مناسب است.

انتخاب فیکساتور مناسب برای برنامه شما

انتخاب فیکساتور مناسب برای آزمایش فلوسیتومتری شما برای به دست آوردن نتایج قابل اعتماد و دقیق بسیار مهم است. فیکساتورهای مختلف برای کاربردهای مختلف مناسب تر هستند. برای مثال، PFA معمولاً برای آنالیز پروتئین سطحی استفاده می‌شود، در حالی که اتانول برای مطالعات مبتنی بر DNA ایده‌آل است.

 

نتیجه گیری

تثبیت سلولی مناسب برای دستیابی به آنالیز موفقیت آمیز فلوسیتومتری ضروری است. این به حفظ ساختارهای سلولی کمک می کند و یکپارچگی پروتئین ها و DNA را تضمین می کند. با پیروی از پروتکل های تثبیت مناسب و اجتناب از تثبیت بیش از حد، محققان می توانند دقت و قابلیت اطمینان داده ها را افزایش دهند. انتخاب تثبیت کننده مناسب برای آزمایش، کیفیت کلی نتایج شما را بهبود می بخشد. اجرای این بهترین شیوه‌ها تضمین می‌کند که آنالیز فلوسیتومتری شما بینش‌های ثابت و تکرارپذیری را در مورد عملکردهای سلولی ارائه می‌دهد.

 

تثبیت سلولی مناسب نقش کلیدی در فلوسیتومتری ایفا می کند و محصولات از HKeybio راه حل های قابل اعتمادی را ارائه می دهد. ارائه آنها نتایج با کیفیت بالا را تضمین می کند و توسط محققان در سراسر جهان برای تجزیه و تحلیل دقیق سلول مورد اعتماد است.

 

سوالات متداول

س: اهمیت تثبیت سلولی در فلوسیتومتری چیست؟

پاسخ: تثبیت سلول در فلوسیتومتری بسیار مهم است زیرا ساختارهای سلولی را حفظ می کند و یکپارچگی پروتئین ها و DNA را برای تجزیه و تحلیل دقیق تضمین می کند.

س: چه مدت باید سلول ها برای فلوسیتومتری ثابت شوند؟

پاسخ: سلول ها معمولاً باید به مدت 15 تا 30 دقیقه با محلول 2-4٪ پارافورمالدئید (PFA) ثابت شوند تا یکپارچگی سلولی حفظ شود.

س: آیا می توانم از اتانول برای تثبیت سلول در فلوسیتومتری استفاده کنم؟

پاسخ: بله، تثبیت اتانول معمولاً برای تجزیه و تحلیل محتوای DNA در فلوسیتومتری، به ویژه برای مطالعات چرخه سلولی استفاده می شود.

س: اگر سلول ها در فلوسیتومتری بیش از حد ثابت شوند چه اتفاقی می افتد؟

A: تثبیت بیش از حد می تواند باعث ایجاد پیوند متقابل بیش از حد شود که منجر به اتوفلورسانس و اتصال ضعیف آنتی بادی می شود که ممکن است بر نتایج فلوسیتومتری تأثیر بگذارد.