Introduzione
Ti sei mai chiesto come la citometria a flusso consente di ottenere un'analisi cellulare così precisa e affidabile? La chiave per risultati accurati risiede nella corretta fissazione delle cellule. La citometria a flusso consente ai ricercatori di studiare una varietà di caratteristiche cellulari, dalla dimensione all'intensità della fluorescenza. Tuttavia, senza un'adeguata fissazione, i dati potrebbero non riflettere le reali proprietà cellulari. In questo articolo esploreremo l'importanza della fissazione cellulare nella citometria a flusso, discuteremo diversi metodi di fissazione e condivideremo suggerimenti per risultati ottimali.
Cos'è la fissazione cellulare nella citometria a flusso?
Definizione di fissazione cellulare
La fissazione cellulare è un processo che stabilizza e preserva le cellule prevenendo cambiamenti nella loro struttura, funzione e composizione molecolare. Questo processo si ottiene reticolando chimicamente proteine, lipidi e altri componenti cellulari, 'congelando' efficacemente le cellule nel loro stato attuale. Ciò è particolarmente importante nella citometria a flusso perché impedisce la degradazione dei marcatori cellulari o l'alterazione delle strutture cellulari durante l'analisi. Fissando le cellule, i ricercatori possono garantire che le caratteristiche delle cellule rimangano coerenti, il che consente misurazioni precise e dati affidabili durante l'analisi della citometria a flusso.
Perché la fissazione è importante
Una corretta fissazione è essenziale perché mantiene l'integrità delle proteine cellulari e degli acidi nucleici, che sono cruciali per un'analisi accurata della citometria a flusso. Se le cellule non vengono fissate, la loro struttura e i marcatori molecolari possono degradarsi o cambiare nel tempo, portando a risultati inaffidabili e imprecisi. La fissazione svolge anche un ruolo fondamentale nella stabilizzazione delle cellule per l'analisi multiparametrica, che è uno dei punti di forza della citometria a flusso. Consente ai ricercatori di valutare simultaneamente più caratteristiche cellulari, come marcatori di superficie, proteine intracellulari e contenuto di DNA, in un unico esperimento. Senza un'adeguata fissazione, i dati ottenuti potrebbero essere incoerenti o incompleti, portando a un'errata interpretazione dei risultati sperimentali.
Tipi di metodi di fissazione per la citometria a flusso
Fissazione della paraformaldeide (PFA).
La paraformaldeide (PFA) è uno dei fissativi più utilizzati nella citometria a flusso, principalmente per la sua efficacia nel preservare la morfologia e l'antigenicità cellulare. Funziona reticolando le proteine all'interno delle cellule, garantendo che sia la struttura cellulare che le proteine di superficie rimangano intatte. Ciò rende la PFA una scelta eccellente per preservare i marcatori della superficie cellulare, soprattutto quando si analizza l'espressione delle proteine di superficie negli esperimenti di immunofenotipizzazione.
Raccomandazione:
● Concentrazione: per una fissazione ottimale viene comunemente utilizzato il 2-4% di PFA.
● Tempo di fissazione: le cellule devono essere incubate in PFA per 15-30 minuti a 2-8°C.
● Conservazione: dopo la fissazione, le cellule devono essere conservate a 2-8°C per una conservazione a breve termine. È importante non conservare le celle fisse per periodi prolungati, poiché ciò potrebbe portare alla perdita dell'integrità del marcatore.
È importante evitare una fissazione eccessiva, poiché l'esposizione prolungata al PFA può portare all'autofluorescenza cellulare e interferire con la successiva colorazione e analisi. Utilizzare sempre il tempo minimo richiesto per la fissazione.
Fissazione dell'etanolo
La fissazione con etanolo viene comunemente utilizzata quando il focus dell'analisi è sul contenuto di DNA, come negli studi sul ciclo cellulare. L'etanolo è un agente disidratante che agisce penetrando nella membrana cellulare e preservando il DNA all'interno delle cellule. Ciò rende la fissazione con etanolo particolarmente utile per i test basati sul DNA e le analisi di citometria a flusso in cui vengono esaminati gli stadi del ciclo cellulare o il contenuto del DNA.
Raccomandazione:
● Concentrazione: in genere viene utilizzato etanolo al 70-100%.
● Tempo di fissazione: la fissazione con etanolo richiede in genere 10-15 minuti per ottenere risultati ottimali.
La fissazione con etanolo è ideale per preservare le fasi del ciclo cellulare e può essere utilizzata in combinazione con coloranti leganti il DNA come lo ioduro di propidio (PI) per l'analisi del ciclo cellulare.
Fissazione del metanolo
Il metanolo è un altro fissativo comunemente utilizzato, soprattutto per le analisi intracellulari. Agisce penetrando nella membrana cellulare e stabilizzando le strutture interne della cellula. Sebbene il metanolo sia efficace nel preservare le proteine e gli antigeni cellulari, può causare il restringimento cellulare, che potrebbe influenzare l’interpretazione di alcune caratteristiche, come la dimensione e la morfologia cellulare.
Raccomandazione:
● Concentrazione: in genere viene utilizzato il 90-100% di metanolo.
● Tempo di fissazione: solitamente sono sufficienti 10-15 minuti.
La fissazione con metanolo viene spesso utilizzata quando si studiano le proteine intracellulari, soprattutto quando si esaminano i marcatori all'interno del citoplasma o del nucleo. Tuttavia, i ricercatori dovrebbero considerare il potenziale di restringimento cellulare quando si utilizza la fissazione con metanolo.
Altri fissativi (ad es. Formalina)
La formalina, una soluzione di formaldeide in acqua, è un altro fissativo utilizzato nella citometria a flusso, sebbene sia meno comune del PFA. La formalina è ampiamente utilizzata in istologia e immunoistochimica, dove conserva efficacemente i campioni di tessuto per l'analisi microscopica. Sebbene la formalina possa preservare le strutture cellulari, generalmente non è consigliata per la citometria a flusso a meno che non si lavori con campioni di tessuto fissati, poiché può interferire con lo smistamento cellulare e alcune applicazioni di fluorescenza. La fissazione con formalina è più adatta per campioni di tessuto, non per singole cellule.
Fissativo |
Concentrazione |
Tempo di fissazione |
Utilizzo consigliato |
Paraformaldeide (PFA) |
2-4% |
15-30 minuti |
Ideale per preservare i marcatori della superficie cellulare; comune per l’immunofenotipizzazione |
Etanolo |
70-100% |
10-15 minuti |
Ideale per l'analisi del contenuto del DNA e gli studi sul ciclo cellulare |
Metanolo |
90-100% |
10-15 minuti |
Adatto per l'analisi delle proteine intracellulari; può causare il restringimento delle cellule |
Formalina |
10% (formaldeide) |
Varia (dipende dal tessuto) |
Generalmente utilizzato per campioni di tessuto fissati, non per singole cellule |
Guida passo passo per fissare le cellule per la citometria a flusso
Preparazione del campione di cellule
Prima della fissazione, è essenziale isolare le cellule dal tessuto o dal campione di sangue. La centrifugazione è il metodo più comune utilizzato per concentrare le cellule in una sospensione. È inoltre fondamentale lavare accuratamente le cellule per rimuovere eventuali terreni di coltura o contaminanti residui, che potrebbero interferire con il processo di fissazione.
1. Isolamento cellulare: utilizzare metodi di isolamento standard come la centrifugazione o lo smistamento cellulare per separare le cellule di interesse.
2. Lavaggio: lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere supporti residui e contaminanti che potrebbero influenzare il processo di fissazione.
Procedura di fissazione
Una volta preparate le cellule, il passo successivo è aggiungere il fissativo alla sospensione cellulare. Il fissativo più comunemente utilizzato per la citometria a flusso è una soluzione PFA al 2-4%.
1. Aggiungere il fissativo alla sospensione cellulare, assicurandosi che sia ben miscelato.
2. Incubare le cellule con il fissativo per 15-30 minuti a 2-8°C.
3. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con PBS per rimuovere il fissativo in eccesso.
Passaggi post-fissazione
Dopo la fissazione, le cellule devono essere maneggiate con cura. Se sono necessarie ulteriori analisi, le cellule devono essere colorate prima dell'analisi. Se si intende conservare le cellule per analisi future, risospenderle in un tampone appropriato e conservarle a 2-8°C. Evitare di lasciare le cellule nel fissativo per lunghi periodi, poiché una fissazione eccessiva può portare ad un aumento dell'autofluorescenza e ad una ridotta qualità del segnale.
Suggerimenti per la fissazione ottimale nella citometria a flusso
Evitare la fissazione eccessiva
La fissazione eccessiva si verifica quando le cellule sono esposte al fissativo per troppo tempo, il che può provocare un'eccessiva reticolazione delle proteine cellulari e compromettere la qualità dei dati. Ciò può portare ad autofluorescenza, riduzione del legame degli anticorpi e misurazioni imprecise della citometria a flusso. Controllare sempre i tempi di fissazione consigliati per il tipo di cellula specifico ed eseguire l'esperimento per evitare una fissazione eccessiva.
Tempo di fissazione rispetto al tipo di campione
Il tempo di fissazione ottimale può variare a seconda del tipo di cellula e della natura dell'esperimento. Ad esempio, le cellule immunitarie possono richiedere tempi di fissazione più brevi rispetto ai campioni di tessuto. Regolare il tempo di fissazione in base alle esigenze specifiche del tipo di campione. Per l'analisi delle proteine di superficie, solitamente è sufficiente un tempo di fissazione più breve (10-15 minuti). Per la colorazione intracellulare o l'analisi del DNA potrebbe essere necessario un tempo di fissazione più lungo.
Colorazione dopo la fissazione
Dopo aver fissato le cellule, la colorazione con anticorpi o coloranti fluorescenti è un passaggio fondamentale nell'analisi della citometria a flusso. Alcuni coloranti fluorescenti, in particolare i coloranti tandem, possono essere sensibili alla fissazione e possono degradarsi se le cellule vengono fissate eccessivamente. Per risultati di colorazione ottimali, si consiglia di colorare le cellule prima della fissazione, quando possibile. Ciò può aiutare a prevenire la degradazione del colorante e garantire segnali di fluorescenza più forti.
Memorizzazione di cellule fisse per la citometria a flusso
Conservazione a breve termine
Per la conservazione a breve termine, le cellule fissate possono essere conservate in frigorifero a 2-8°C. Questo è l'ideale quando si prevede di analizzare le cellule entro uno o due giorni dalla fissazione. Conservare sempre le cellule fisse al buio per evitare il fotosbiancamento, che può influenzare i segnali fluorescenti.
Conservazione a lungo termine
Per la conservazione a lungo termine, le cellule possono essere congelate in mezzi di crioconservazione. Un tipico mezzo di crioconservazione è costituito dal 10% di dimetilsolfossido (DMSO) e dal 90% di siero bovino fetale (FBS). Tuttavia, sono disponibili anche soluzioni di crioconservazione senza siero come mFreSR™ o CryoStor™ CS10 che possono essere utilizzate per evitare problemi associati a FBS. Per prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio, utilizzare un congelatore a velocità controllata per congelare le cellule. Ciò aiuta a mantenere la vitalità cellulare e garantisce una corretta conservazione.
Insidie comuni da evitare nella fissazione delle cellule per la citometria a flusso
Effetti di una fissazione impropria
Una fissazione impropria può portare a diversi problemi, tra cui autofluorescenza, ridotto legame anticorpale e scarsa vitalità cellulare. Questi problemi possono influenzare in modo significativo l'accuratezza e l'affidabilità dei risultati della citometria a flusso. Verificare sempre i protocolli di fissazione per il tipo di campione specifico e assicurarsi che le condizioni di fissazione siano appropriate per il tipo di cellula e i marcatori da analizzare.
Scegliere il fissativo giusto per la tua applicazione
La scelta del fissativo appropriato per il tuo esperimento di citometria a flusso è fondamentale per ottenere risultati affidabili e accurati. Fissativi diversi sono più adatti per applicazioni diverse. Ad esempio, il PFA è comunemente utilizzato per l'analisi delle proteine di superficie, mentre l'etanolo è ideale per gli studi basati sul DNA. Prima di iniziare l'esperimento, ricerca il miglior fissativo per la tua specifica applicazione e adatta di conseguenza il protocollo di fissazione.
Conclusione
Una corretta fissazione delle cellule è essenziale per ottenere un'analisi di citometria a flusso di successo. Aiuta a preservare le strutture cellulari e garantisce l'integrità delle proteine e del DNA. Seguendo protocolli di fissazione adeguati ed evitando una fissazione eccessiva, i ricercatori possono migliorare l'accuratezza e l'affidabilità dei dati. La selezione del fissativo appropriato per il tuo esperimento migliora la qualità complessiva dei risultati. L'implementazione di queste migliori pratiche garantisce che l'analisi della citometria a flusso fornisca informazioni coerenti e riproducibili sulle funzioni cellulari.
La corretta fissazione cellulare gioca un ruolo chiave nella citometria a flusso e nei prodotti da HKeybio offre soluzioni affidabili. Le loro offerte garantiscono risultati di alta qualità e godono della fiducia dei ricercatori di tutto il mondo per analisi cellulari accurate.
Domande frequenti
D: Qual è l'importanza della fissazione cellulare nella citometria a flusso?
R: La fissazione cellulare è fondamentale nella citometria a flusso poiché preserva le strutture cellulari e garantisce l'integrità delle proteine e del DNA per un'analisi accurata.
D: Per quanto tempo devono essere fissate le cellule per la citometria a flusso?
R: In genere, le cellule devono essere fissate per 15-30 minuti con una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 2-4% per mantenere l'integrità cellulare.
D: Posso utilizzare l'etanolo per la fissazione cellulare nella citometria a flusso?
R: Sì, la fissazione con etanolo è comunemente utilizzata per l'analisi del contenuto di DNA nella citometria a flusso, in particolare per gli studi sul ciclo cellulare.
D: Cosa succede se le cellule vengono fissate eccessivamente nella citometria a flusso?
R: Una fissazione eccessiva può causare un'eccessiva reticolazione, con conseguente autofluorescenza e scarso legame degli anticorpi, che possono influenzare i risultati della citometria a flusso.
