Einführung
Haben Sie sich jemals gefragt, wie? Die Durchflusszytometrie ermöglicht eine so präzise und zuverlässige Zellanalyse? Der Schlüssel zu genauen Ergebnissen liegt in der richtigen Zellfixierung. Mithilfe der Durchflusszytometrie können Forscher eine Vielzahl zellulärer Eigenschaften untersuchen, von der Größe bis zur Fluoreszenzintensität. Ohne ordnungsgemäße Fixierung spiegeln die Daten jedoch möglicherweise nicht die tatsächlichen Zelleigenschaften wider. In diesem Artikel werden wir die Bedeutung der Zellfixierung in der Durchflusszytometrie untersuchen, verschiedene Fixierungsmethoden diskutieren und Tipps für optimale Ergebnisse geben.
Was ist Zellfixierung in der Durchflusszytometrie?
Definition von Zellfixierung
Zellfixierung ist ein Prozess, der die Zellen stabilisiert und konserviert, indem er Veränderungen in ihrer Struktur, Funktion und molekularen Zusammensetzung verhindert. Dieser Prozess wird durch die chemische Vernetzung von Proteinen, Lipiden und anderen Zellbestandteilen erreicht, wodurch die Zellen effektiv in ihrem aktuellen Zustand „eingefroren“ werden. Dies ist besonders wichtig in der Durchflusszytometrie, da es den Abbau zellulärer Marker oder die Veränderung zellulärer Strukturen während der Analyse verhindert. Durch die Fixierung der Zellen können Forscher sicherstellen, dass die Eigenschaften der Zellen konsistent bleiben, was präzise Messungen und zuverlässige Daten während der Durchflusszytometrieanalyse ermöglicht.
Warum Fixierung wichtig ist
Eine ordnungsgemäße Fixierung ist von wesentlicher Bedeutung, da sie die Integrität zellulärer Proteine und Nukleinsäuren aufrechterhält, die für eine genaue Durchflusszytometrieanalyse von entscheidender Bedeutung sind. Wenn Zellen nicht fixiert sind, können sich ihre Struktur und ihre molekularen Marker im Laufe der Zeit verschlechtern oder verändern, was zu unzuverlässigen und ungenauen Ergebnissen führt. Die Fixierung spielt auch eine entscheidende Rolle bei der Stabilisierung von Zellen für die Multiparameter-Analyse, was eine der Hauptstärken der Durchflusszytometrie darstellt. Es ermöglicht Forschern, in einem einzigen Experiment gleichzeitig mehrere Zellmerkmale wie Oberflächenmarker, intrazelluläre Proteine und DNA-Gehalt zu bewerten. Ohne ordnungsgemäße Fixierung könnten die erhaltenen Daten inkonsistent oder unvollständig sein, was zu einer Fehlinterpretation der experimentellen Ergebnisse führen könnte.
Arten von Fixierungsmethoden für die Durchflusszytometrie
Fixierung mit Paraformaldehyd (PFA).
Paraformaldehyd (PFA) ist eines der am häufigsten verwendeten Fixiermittel in der Durchflusszytometrie, vor allem aufgrund seiner Wirksamkeit bei der Erhaltung der Zellmorphologie und Antigenität. Es funktioniert durch die Vernetzung von Proteinen innerhalb der Zellen und sorgt so dafür, dass sowohl die Zellstruktur als auch die Oberflächenproteine intakt bleiben. Dies macht PFA zu einer ausgezeichneten Wahl für die Konservierung von Zelloberflächenmarkern, insbesondere bei der Analyse der Oberflächenproteinexpression in Experimenten zur Immunphänotypisierung.
Empfehlung:
● Konzentration: 2–4 % PFA werden üblicherweise für eine optimale Fixierung verwendet.
● Fixierungszeit: Zellen sollten 15–30 Minuten lang bei 2–8 °C in PFA inkubiert werden.
● Lagerung: Nach der Fixierung sollten die Zellen zur kurzfristigen Lagerung bei 2–8 °C gelagert werden. Es ist wichtig, fixierte Zellen nicht über einen längeren Zeitraum aufzubewahren, da dies zum Verlust der Markerintegrität führen kann.
Es ist wichtig, eine Überfixierung zu vermeiden, da eine längere PFA-Exposition zu zellulärer Autofluoreszenz führen und die nachfolgende Färbung und Analyse beeinträchtigen kann. Nehmen Sie sich für die Fixierung immer die minimal erforderliche Zeit.
Ethanol-Fixierung
Die Ethanolfixierung wird häufig verwendet, wenn der Schwerpunkt der Analyse auf dem DNA-Gehalt liegt, beispielsweise bei Zellzyklusstudien. Ethanol ist ein dehydrierendes Mittel, das die Zellmembran durchdringt und die DNA in den Zellen konserviert. Dies macht die Ethanolfixierung besonders nützlich für DNA-basierte Tests und Durchflusszytometrie-Analysen, bei denen Zellzyklusstadien oder der DNA-Gehalt untersucht werden.
Empfehlung:
● Konzentration: Typischerweise werden 70–100 % Ethanol verwendet.
● Fixierungszeit: Für optimale Ergebnisse dauert die Ethanolfixierung normalerweise 10–15 Minuten.
Die Ethanolfixierung ist ideal für die Konservierung von Zellzyklusphasen und kann in Kombination mit DNA-bindenden Farbstoffen wie Propidiumiodid (PI) für die Zellzyklusanalyse verwendet werden.
Methanol-Fixierung
Methanol ist ein weiteres häufig verwendetes Fixiermittel, insbesondere für intrazelluläre Analysen. Es dringt in die Zellmembran ein und stabilisiert die inneren Strukturen der Zelle. Während Methanol bei der Konservierung zellulärer Proteine und Antigene wirksam ist, kann es zu einer Zellschrumpfung führen, die sich auf die Interpretation bestimmter Merkmale wie Zellgröße und -morphologie auswirken kann.
Empfehlung:
● Konzentration: Typischerweise werden 90–100 % Methanol verwendet.
● Fixierungszeit: 10–15 Minuten sind normalerweise ausreichend.
Die Methanolfixierung wird häufig bei der Untersuchung intrazellulärer Proteine eingesetzt, insbesondere bei der Untersuchung von Markern im Zytoplasma oder Zellkern. Forscher sollten jedoch die Möglichkeit einer Zellschrumpfung bei der Methanolfixierung berücksichtigen.
Andere Fixiermittel (z. B. Formalin)
Formalin, eine Lösung von Formaldehyd in Wasser, ist ein weiteres Fixiermittel, das in der Durchflusszytometrie verwendet wird, obwohl es weniger verbreitet ist als PFA. Formalin wird häufig in der Histologie und Immunhistochemie eingesetzt, wo es Gewebeproben für die mikroskopische Analyse effektiv konserviert. Obwohl Formalin Zellstrukturen bewahren kann, wird es im Allgemeinen nicht für die Durchflusszytometrie empfohlen, es sei denn, es wird mit fixierten Gewebeproben gearbeitet, da es die Zellsortierung und einige Fluoreszenzanwendungen beeinträchtigen kann. Die Formalinfixierung eignet sich am besten für Gewebeproben, nicht für einzelne Zellen.
Fixativ |
Konzentration |
Fixierungszeit |
Empfohlene Verwendung |
Paraformaldehyd (PFA) |
2-4 % |
15-30 Minuten |
Ideal zur Konservierung von Zelloberflächenmarkern; häufig bei der Immunphänotypisierung |
Ethanol |
70-100 % |
10-15 Minuten |
Ideal für DNA-Inhaltsanalysen und Zellzyklusstudien |
Methanol |
90-100 % |
10-15 Minuten |
Geeignet für die intrazelluläre Proteinanalyse; kann zu Zellschrumpfung führen |
Formalin |
10 % (Formaldehyd) |
Variiert (je nach Gewebe) |
Wird im Allgemeinen für fixierte Gewebeproben verwendet, nicht für einzelne Zellen |
Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Fixieren von Zellen für die Durchflusszytometrie
Vorbereiten der Zellprobe
Vor der Fixierung ist es unbedingt erforderlich, die Zellen aus der Gewebe- oder Blutprobe zu isolieren. Zentrifugation ist die am häufigsten verwendete Methode zur Konzentration von Zellen in einer Suspension. Es ist außerdem wichtig, die Zellen gründlich zu waschen, um alle Kulturmedien oder restlichen Verunreinigungen zu entfernen, die den Fixierungsprozess beeinträchtigen könnten.
1. Zellisolierung: Verwenden Sie Standardisolierungsmethoden wie Zentrifugation oder Zellsortierung, um die gewünschten Zellen zu trennen.
2. Waschen: Waschen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um restliche Medien und Verunreinigungen zu entfernen, die den Fixierungsprozess beeinträchtigen könnten.
Fixierungsverfahren
Sobald die Zellen vorbereitet sind, besteht der nächste Schritt darin, der Zellsuspension das Fixiermittel hinzuzufügen. Das am häufigsten verwendete Fixiermittel für die Durchflusszytometrie ist eine 2–4 %ige PFA-Lösung.
1. Geben Sie das Fixiermittel zur Zellsuspension hinzu und achten Sie darauf, dass es gut vermischt ist.
2. Inkubieren Sie die Zellen mit dem Fixiermittel 15–30 Minuten lang bei 2–8 °C.
3. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation zweimal mit PBS, um überschüssiges Fixiermittel zu entfernen.
Schritte nach der Fixierung
Nach der Fixierung müssen die Zellen sorgfältig gehandhabt werden. Wenn eine weitere Analyse erforderlich ist, sollten die Zellen vor der Analyse gefärbt werden. Wenn Sie die Zellen für zukünftige Analysen aufbewahren möchten, resuspendieren Sie sie in einem geeigneten Puffer und lagern Sie sie bei 2–8 °C. Vermeiden Sie es, die Zellen über einen längeren Zeitraum im Fixiermittel zu belassen, da eine übermäßige Fixierung zu einer erhöhten Autofluoreszenz und einer verminderten Signalqualität führen kann.
Tipps zur optimalen Fixierung in der Durchflusszytometrie
Überfixierung vermeiden
Eine Überfixierung tritt auf, wenn Zellen zu lange dem Fixiermittel ausgesetzt sind, was zu einer übermäßigen Vernetzung zellulärer Proteine führen und die Qualität der Daten beeinträchtigen kann. Dies kann zu Autofluoreszenz, verminderter Antikörperbindung und ungenauen Durchflusszytometriemessungen führen. Überprüfen Sie immer die empfohlenen Fixierungszeiten für Ihren spezifischen Zelltyp und Ihr Experiment, um eine Überfixierung zu vermeiden.
Fixierungszeit vs. Probentyp
Die optimale Fixierungszeit kann je nach Zelltyp und Art des Experiments variieren. Beispielsweise benötigen Immunzellen möglicherweise kürzere Fixierungszeiten als Gewebeproben. Passen Sie die Fixierungszeit an die spezifischen Anforderungen des Probentyps an. Für die Oberflächenproteinanalyse ist in der Regel eine kürzere Fixierungszeit (10–15 Minuten) ausreichend. Für intrazelluläre Färbungen oder DNA-Analysen kann eine längere Fixierungszeit erforderlich sein.
Färbung nach der Fixierung
Nach der Fixierung der Zellen ist die Färbung mit Antikörpern oder Fluoreszenzfarbstoffen ein entscheidender Schritt in der Durchflusszytometrie-Analyse. Einige Fluoreszenzfarbstoffe, insbesondere Tandemfarbstoffe, können empfindlich auf die Fixierung reagieren und sich bei übermäßiger Fixierung der Zellen verschlechtern. Für optimale Färbeergebnisse wird empfohlen, die Zellen nach Möglichkeit vor der Fixierung zu färben. Dies kann dazu beitragen, den Abbau des Farbstoffs zu verhindern und stärkere Fluoreszenzsignale sicherzustellen.
Speicherung fixierter Zellen für die Durchflusszytometrie
Kurzfristige Lagerung
Für eine kurzfristige Lagerung können fixierte Zellen im Kühlschrank bei 2–8 °C aufbewahrt werden. Dies ist ideal, wenn Sie die Zellen innerhalb von ein oder zwei Tagen nach der Fixierung analysieren möchten. Lagern Sie fixierte Zellen immer im Dunkeln, um Photobleichung zu verhindern, die die Fluoreszenzsignale beeinträchtigen kann.
Langzeitlagerung
Zur Langzeitlagerung können Zellen in Kryokonservierungsmedien eingefroren werden. Ein typisches Kryokonservierungsmedium besteht aus 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) und 90 % fötalem Rinderserum (FBS). Allerdings sind auch serumfreie Kryokonservierungslösungen wie mFreSR™ oder CryoStor™ CS10 erhältlich und können verwendet werden, um Probleme im Zusammenhang mit FBS zu vermeiden. Um die Bildung von Eiskristallen zu verhindern, verwenden Sie zum Einfrieren der Zellen einen Gefrierschrank mit kontrollierter Geschwindigkeit. Dies trägt dazu bei, die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechtzuerhalten und eine ordnungsgemäße Lagerung sicherzustellen.
Häufige Fallstricke, die es bei der Zellfixierung für die Durchflusszytometrie zu vermeiden gilt
Auswirkungen einer unsachgemäßen Fixierung
Eine unsachgemäße Fixierung kann zu mehreren Problemen führen, darunter Autofluoreszenz, verringerte Antikörperbindung und schlechte Lebensfähigkeit der Zellen. Diese Probleme können die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse der Durchflusszytometrie erheblich beeinträchtigen. Überprüfen Sie immer die Fixierungsprotokolle für Ihren spezifischen Probentyp und stellen Sie sicher, dass die Fixierungsbedingungen für den zu analysierenden Zelltyp und die Marker geeignet sind.
Auswahl des richtigen Fixiermittels für Ihre Anwendung
Die Wahl des geeigneten Fixiermittels für Ihr Durchflusszytometrie-Experiment ist entscheidend, um zuverlässige und genaue Ergebnisse zu erhalten. Unterschiedliche Fixiermittel sind für unterschiedliche Anwendungen besser geeignet. PFA wird beispielsweise häufig für die Analyse von Oberflächenproteinen verwendet, während Ethanol ideal für DNA-basierte Studien ist. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, recherchieren Sie nach dem besten Fixiermittel für Ihre spezifische Anwendung und passen Sie das Fixierungsprotokoll entsprechend an.
Abschluss
Eine ordnungsgemäße Zellfixierung ist für eine erfolgreiche Durchflusszytometrieanalyse unerlässlich. Es trägt zur Erhaltung der Zellstrukturen bei und gewährleistet die Integrität von Proteinen und DNA. Durch die Einhaltung geeigneter Fixierungsprotokolle und die Vermeidung einer Überfixierung können Forscher die Datengenauigkeit und -zuverlässigkeit verbessern. Die Auswahl des geeigneten Fixiermittels für Ihr Experiment verbessert die Gesamtqualität Ihrer Ergebnisse. Durch die Implementierung dieser Best Practices wird sichergestellt, dass Ihre Durchflusszytometrieanalyse konsistente, reproduzierbare Einblicke in die Zellfunktionen liefert.
Die richtige Zellfixierung spielt eine Schlüsselrolle in der Durchflusszytometrie und den daraus hergestellten Produkten HKeybio bietet zuverlässige Lösungen. Ihre Angebote gewährleisten qualitativ hochwertige Ergebnisse und genießen bei Forschern auf der ganzen Welt das Vertrauen für genaue Zellanalysen.
FAQ
F: Welche Bedeutung hat die Zellfixierung in der Durchflusszytometrie?
A: Die Zellfixierung ist in der Durchflusszytometrie von entscheidender Bedeutung, da sie die Zellstrukturen bewahrt und die Integrität von Proteinen und DNA für eine genaue Analyse gewährleistet.
F: Wie lange sollten Zellen für die Durchflusszytometrie fixiert werden?
A: Zellen sollten normalerweise 15–30 Minuten lang mit einer 2–4 %igen Paraformaldehydlösung (PFA) fixiert werden, um die Zellintegrität aufrechtzuerhalten.
F: Kann ich Ethanol zur Zellfixierung in der Durchflusszytometrie verwenden?
A: Ja, die Ethanolfixierung wird häufig zur Analyse des DNA-Gehalts in der Durchflusszytometrie verwendet, insbesondere für Zellzyklusstudien.
F: Was passiert, wenn Zellen in der Durchflusszytometrie überfixiert werden?
A: Übermäßige Fixierung kann zu übermäßiger Vernetzung führen, was zu Autofluoreszenz und schlechter Antikörperbindung führt, was sich auf die Ergebnisse der Durchflusszytometrie auswirken kann.
