Wstęp
Czy zastanawiałeś się kiedyś jak cytometria przepływowa umożliwia tak precyzyjną i niezawodną analizę komórek? Kluczem do dokładnych wyników jest prawidłowe utrwalenie komórek. Cytometria przepływowa umożliwia naukowcom badanie różnych cech komórkowych, od wielkości po intensywność fluorescencji. Jednak bez odpowiedniego utrwalenia dane mogą nie odzwierciedlać prawdziwych właściwości komórkowych. W tym artykule zbadamy znaczenie utrwalania komórek w cytometrii przepływowej, omówimy różne metody utrwalania i podzielimy się wskazówkami dotyczącymi uzyskania optymalnych wyników.
Co to jest utrwalanie komórek w cytometrii przepływowej?
Definicja utrwalania komórek
Utrwalanie komórek to proces stabilizujący i konserwujący komórki, zapobiegając zmianom w ich strukturze, funkcji i składzie molekularnym. Proces ten osiąga się poprzez chemiczne sieciowanie białek, lipidów i innych składników komórkowych, skutecznie „zamrażając” komórki w ich obecnym stanie. Jest to szczególnie ważne w cytometrii przepływowej, ponieważ zapobiega degradacji markerów komórkowych lub zmianom struktur komórkowych podczas analizy. Utrwalając komórki, badacze mogą zapewnić spójność cech komórek, co pozwala na precyzyjne pomiary i wiarygodne dane podczas analizy metodą cytometrii przepływowej.
Dlaczego fiksacja jest ważna
Prawidłowe utrwalenie jest niezbędne, ponieważ utrzymuje integralność białek komórkowych i kwasów nukleinowych, które są kluczowe dla dokładnej analizy metodą cytometrii przepływowej. Jeśli komórki nie zostaną utrwalone, ich struktura i markery molekularne mogą z czasem ulec degradacji lub zmianie, co prowadzi do niewiarygodnych i niedokładnych wyników. Utrwalanie odgrywa również kluczową rolę w stabilizacji komórek na potrzeby analizy wieloparametrowej, co jest jedną z kluczowych zalet cytometrii przepływowej. Umożliwia badaczom jednoczesną ocenę wielu cech komórek, takich jak markery powierzchniowe, białka wewnątrzkomórkowe i zawartość DNA, w jednym eksperymencie. Bez odpowiedniego utrwalenia uzyskane dane mogą być niespójne lub niekompletne, co może prowadzić do błędnej interpretacji wyników eksperymentów.
Rodzaje metod utrwalania w cytometrii przepływowej
Utrwalanie paraformaldehydem (PFA).
Paraformaldehyd (PFA) jest jednym z najczęściej stosowanych utrwalaczy w cytometrii przepływowej, głównie ze względu na jego skuteczność w zachowaniu morfologii i antygenowości komórek. Działa poprzez sieciowanie białek w komórkach, zapewniając, że zarówno struktura komórkowa, jak i białka powierzchniowe pozostają nienaruszone. To sprawia, że PFA jest doskonałym wyborem do konserwacji markerów powierzchniowych komórek, szczególnie podczas analizy ekspresji białek powierzchniowych w eksperymentach immunofenotypowych.
Zalecenie:
● Stężenie: W celu optymalnego utrwalenia powszechnie stosuje się 2-4% PFA.
● Czas utrwalania: Komórki należy inkubować w PFA przez 15-30 minut w temperaturze 2-8°C.
● Przechowywanie: Po utrwaleniu komórki należy przechowywać w temperaturze 2–8°C w celu krótkotrwałego przechowywania. Ważne jest, aby nie przechowywać utrwalonych komórek przez dłuższy czas, ponieważ może to prowadzić do utraty integralności markera.
Ważne jest, aby unikać nadmiernego utrwalania, ponieważ długotrwałe narażenie na PFA może prowadzić do autofluorescencji komórkowej i zakłócać późniejsze barwienie i analizę. Zawsze używaj minimalnej wymaganej ilości czasu na utrwalenie.
Utrwalanie etanolu
Utrwalanie etanolem jest powszechnie stosowane, gdy analiza koncentruje się na zawartości DNA, na przykład w badaniach cyklu komórkowego. Etanol jest środkiem odwadniającym, który przenika przez błonę komórkową i konserwuje DNA w komórkach. To sprawia, że utrwalanie etanolu jest szczególnie przydatne w testach opartych na DNA i analizach cytometrii przepływowej, gdzie badane są etapy cyklu komórkowego lub zawartość DNA.
Zalecenie:
● Stężenie: Zwykle stosuje się 70-100% etanolu.
● Czas utrwalania: Utrwalanie etanolem zwykle wymaga 10-15 minut, aby uzyskać optymalne rezultaty.
Utrwalanie etanolem idealnie nadaje się do konserwacji faz cyklu komórkowego i można je stosować w połączeniu z barwnikami wiążącymi DNA, takimi jak jodek propidyny (PI), do analizy cyklu komórkowego.
Utrwalanie metanolu
Innym powszechnie stosowanym utrwalaczem, szczególnie w analizach wewnątrzkomórkowych, jest metanol. Działa poprzez penetrację błony komórkowej i stabilizację wewnętrznych struktur komórki. Chociaż metanol skutecznie konserwuje białka komórkowe i antygeny, może powodować kurczenie się komórek, co może mieć wpływ na interpretację pewnych cech, takich jak wielkość i morfologia komórek.
Zalecenie:
● Stężenie: Zazwyczaj stosuje się 90-100% metanol.
● Czas utrwalania: zwykle wystarcza 10-15 minut.
Podczas badania białek wewnątrzkomórkowych, zwłaszcza podczas badania markerów wewnątrz cytoplazmy lub jądra, często stosuje się utrwalanie metanolem. Jednakże badacze powinni wziąć pod uwagę możliwość kurczenia się komórek podczas stosowania utrwalania metanolem.
Inne utrwalacze (np. formalina)
Formalina, roztwór formaldehydu w wodzie, to kolejny utrwalacz stosowany w cytometrii przepływowej, chociaż jest mniej powszechny niż PFA. Formalina jest szeroko stosowana w histologii i immunohistochemii, gdzie skutecznie konserwuje próbki tkanek do analizy mikroskopowej. Chociaż formalina może zachować struktury komórkowe, generalnie nie jest zalecana do cytometrii przepływowej, chyba że pracuje się z utrwalonymi próbkami tkanek, ponieważ może zakłócać sortowanie komórek i niektóre zastosowania fluorescencyjne. Utrwalanie formaliną najlepiej nadaje się do próbek tkanek, a nie pojedynczych komórek.
Utrwalający |
Stężenie |
Czas fiksacji |
Zalecane użycie |
Paraformaldehyd (PFA) |
2-4% |
15-30 minut |
Idealny do konserwacji markerów powierzchniowych komórek; wspólne dla immunofenotypowania |
Etanol |
70-100% |
10-15 minut |
Najlepsze do analizy zawartości DNA i badań cyklu komórkowego |
Metanol |
90-100% |
10-15 minut |
Nadaje się do wewnątrzkomórkowej analizy białek; może powodować kurczenie się komórek |
Formalina |
10% (formaldehyd) |
Różnie (w zależności od tkanki) |
Zwykle stosowany do utrwalonych próbek tkanek, a nie pojedynczych komórek |
Przewodnik krok po kroku dotyczący mocowania komórek do cytometrii przepływowej
Przygotowanie próbki komórek
Przed utrwaleniem należy koniecznie odizolować komórki z próbki tkanki lub krwi. Wirowanie jest najpowszechniejszą metodą zatężania komórek w zawiesinie. Bardzo ważne jest również dokładne umycie komórek w celu usunięcia wszelkich pożywek hodowlanych lub pozostałości zanieczyszczeń, które mogłyby zakłócać proces utrwalania.
1. Izolacja komórek: Aby oddzielić interesujące komórki, należy zastosować standardowe metody izolacji, takie jak wirowanie lub sortowanie komórek.
2. Płukanie: Przemyć kuwety solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu usunięcia pozostałości pożywki i zanieczyszczeń, które mogłyby mieć wpływ na proces utrwalania.
Procedura utrwalania
Następnym krokiem po przygotowaniu komórek jest dodanie utrwalacza do zawiesiny komórek. Najczęściej stosowanym utrwalaczem w cytometrii przepływowej jest 2-4% roztwór PFA.
1. Dodaj utrwalacz do zawiesiny komórek, upewniając się, że jest dobrze wymieszany.
2. Inkubować komórki z utrwalaczem przez 15-30 minut w temperaturze 2-8°C.
3. Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie PBS w celu usunięcia nadmiaru utrwalacza.
Kroki po utrwaleniu
Po utrwaleniu z komórkami należy obchodzić się ostrożnie. Jeśli konieczna jest dalsza analiza, komórki należy wybarwić przed analizą. Jeśli planujesz przechowywać komórki do przyszłej analizy, zawieś je w odpowiednim buforze i przechowuj w temperaturze 2–8°C. Unikaj pozostawiania komórek w utrwalaczu przez dłuższy czas, ponieważ nadmierne utrwalenie może prowadzić do zwiększonej autofluorescencji i pogorszenia jakości sygnału.
Wskazówki dotyczące optymalnego mocowania w cytometrii przepływowej
Unikanie nadmiernej fiksacji
Nadmierne utrwalenie ma miejsce, gdy komórki są zbyt długo wystawione na działanie utrwalacza, co może skutkować nadmiernym sieciowaniem białek komórkowych i pogorszeniem jakości danych. Może to prowadzić do autofluorescencji, zmniejszonego wiązania przeciwciał i niedokładnych pomiarów cytometrii przepływowej. Zawsze sprawdzaj zalecane czasy utrwalania dla konkretnego typu komórek i eksperymentuj, aby uniknąć nadmiernego utrwalania.
Czas utrwalania a rodzaj próbki
Optymalny czas utrwalania może się różnić w zależności od rodzaju komórki i charakteru doświadczenia. Na przykład komórki odpornościowe mogą wymagać krótszego czasu utrwalania niż próbki tkanek. Dostosuj czas utrwalania w zależności od konkretnych potrzeb typu próbki. Do analizy białek powierzchniowych zwykle wystarczający jest krótszy czas utrwalania (10–15 minut). W przypadku barwienia wewnątrzkomórkowego lub analizy DNA może być wymagany dłuższy czas utrwalania.
Barwienie po utrwaleniu
Po utrwaleniu komórek barwienie przeciwciałami lub barwnikami fluorescencyjnymi jest kluczowym etapem analizy metodą cytometrii przepływowej. Niektóre barwniki fluorescencyjne, zwłaszcza barwniki tandemowe, mogą być wrażliwe na utrwalenie i mogą ulegać degradacji w przypadku nadmiernego utrwalenia komórek. Aby uzyskać optymalne wyniki barwienia, zaleca się, jeśli to możliwe, wybarwienie komórek przed utrwaleniem. Może to pomóc w zapobieganiu degradacji barwnika i zapewnić silniejsze sygnały fluorescencji.
Przechowywanie utrwalonych komórek do cytometrii przepływowej
Przechowywanie krótkoterminowe
W celu krótkotrwałego przechowywania utrwalone komórki można przechowywać w lodówce w temperaturze 2–8°C. Jest to idealne rozwiązanie, jeśli planujesz analizę komórek w ciągu jednego lub dwóch dni po utrwaleniu. Zawsze przechowuj utrwalone ogniwa w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu, które może mieć wpływ na sygnały fluorescencyjne.
Przechowywanie długoterminowe
W celu długotrwałego przechowywania komórki można zamrozić w pożywce do kriokonserwacji. Typowe podłoże do kriokonserwacji składa się z 10% sulfotlenku dimetylu (DMSO) i 90% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Dostępne są jednak również roztwory do kriokonserwacji niezawierające surowicy, takie jak mFreSR™ lub CryoStor™ CS10, których można używać w celu uniknięcia problemów związanych z FBS. Aby zapobiec tworzeniu się kryształków lodu, do zamrożenia komórek należy używać zamrażarki o kontrolowanej wydajności. Pomaga to utrzymać żywotność komórek i zapewnia właściwe przechowywanie.
Typowe pułapki, których należy unikać podczas utrwalania komórek w cytometrii przepływowej
Skutki nieprawidłowego mocowania
Niewłaściwe utrwalenie może prowadzić do kilku problemów, w tym autofluorescencji, zmniejszonego wiązania przeciwciał i słabej żywotności komórek. Kwestie te mogą znacząco wpłynąć na dokładność i wiarygodność wyników cytometrii przepływowej. Zawsze sprawdzaj protokoły utrwalania dla konkretnego typu próbki i upewnij się, że warunki utrwalania są odpowiednie dla typu komórek i analizowanych markerów.
Wybór odpowiedniego utrwalacza do Twojego zastosowania
Wybór odpowiedniego utrwalacza do eksperymentu z cytometrią przepływową ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych i dokładnych wyników. Różne utrwalacze lepiej nadają się do różnych zastosowań. Na przykład PFA jest powszechnie używany do analizy białek powierzchniowych, podczas gdy etanol jest idealny do badań opartych na DNA. Przed rozpoczęciem eksperymentu znajdź najlepszy utrwalacz do konkretnego zastosowania i odpowiednio dostosuj protokół utrwalania.
Wniosek
Prawidłowe utrwalenie komórek jest niezbędne do uzyskania pomyślnej analizy metodą cytometrii przepływowej. Pomaga zachować struktury komórkowe i zapewnia integralność białek i DNA. Przestrzegając odpowiednich protokołów utrwalania i unikając nadmiernego utrwalania, badacze mogą zwiększyć dokładność i niezawodność danych. Wybór odpowiedniego utrwalacza do eksperymentu poprawia ogólną jakość wyników. Wdrożenie tych najlepszych praktyk gwarantuje, że analiza cytometrii przepływowej zapewni spójne, powtarzalne informacje na temat funkcji komórkowych.
Prawidłowe utrwalenie komórek odgrywa kluczową rolę w cytometrii przepływowej i produktach ich powstawania HKeybio oferuje niezawodne rozwiązania. Ich oferta zapewnia wysoką jakość wyników i cieszy się zaufaniem badaczy na całym świecie w zakresie dokładnej analizy komórek.
Często zadawane pytania
P: Jakie jest znaczenie utrwalania komórek w cytometrii przepływowej?
Odp.: Utrwalanie komórek ma kluczowe znaczenie w cytometrii przepływowej, ponieważ chroni struktury komórkowe i zapewnia integralność białek i DNA na potrzeby dokładnej analizy.
P: Jak długo należy utrwalać komórki do cytometrii przepływowej?
Odp.: Komórki należy zazwyczaj utrwalić przez 15–30 minut 2–4% roztworem paraformaldehydu (PFA), aby zachować integralność komórkową.
P: Czy mogę używać etanolu do utrwalania komórek w cytometrii przepływowej?
Odpowiedź: Tak, utrwalanie etanolem jest powszechnie stosowane do analizy zawartości DNA w cytometrii przepływowej, szczególnie w badaniach cyklu komórkowego.
P: Co się stanie, jeśli komórki zostaną nadmiernie utrwalone w cytometrii przepływowej?
Odp.: Nadmierne utrwalenie może powodować nadmierne sieciowanie, prowadzące do autofluorescencji i słabego wiązania przeciwciał, co może mieć wpływ na wyniki cytometrii przepływowej.
