Invoering
Heb je je ooit afgevraagd hoe flowcytometrie een dergelijke nauwkeurige en betrouwbare celanalyse mogelijk maakt? De sleutel tot nauwkeurige resultaten ligt in een goede celfixatie. Met flowcytometrie kunnen onderzoekers een verscheidenheid aan cellulaire kenmerken bestuderen, van grootte tot fluorescentie-intensiteit. Zonder de juiste fixatie weerspiegelen de gegevens echter mogelijk niet de echte cellulaire eigenschappen. In dit artikel onderzoeken we het belang van celfixatie bij flowcytometrie, bespreken we verschillende fixatiemethoden en delen we tips voor optimale resultaten.
Wat is celfixatie bij flowcytometrie?
Definitie van celfixatie
Celfixatie is een proces dat de cellen stabiliseert en behoudt door veranderingen in hun structuur, functie en moleculaire samenstelling te voorkomen. Dit proces wordt bereikt door eiwitten, lipiden en andere cellulaire componenten chemisch te verknopen, waardoor de cellen effectief in hun huidige staat worden 'bevroren'. Dit is vooral belangrijk bij flowcytometrie omdat het de afbraak van cellulaire markers of de verandering van cellulaire structuren tijdens de analyse voorkomt. Door de cellen te fixeren kunnen onderzoekers ervoor zorgen dat de kenmerken van de cellen consistent blijven, wat nauwkeurige metingen en betrouwbare gegevens tijdens flowcytometrie-analyse mogelijk maakt.
Waarom fixatie belangrijk is
Een goede fixatie is essentieel omdat het de integriteit van cellulaire eiwitten en nucleïnezuren handhaaft, die cruciaal zijn voor nauwkeurige flowcytometrieanalyse. Als cellen niet gefixeerd zijn, kunnen hun structuur en moleculaire markers in de loop van de tijd verslechteren of veranderen, wat tot onbetrouwbare en onnauwkeurige resultaten kan leiden. Fixatie speelt ook een cruciale rol bij het stabiliseren van cellen voor multiparameteranalyse, wat een van de belangrijkste sterke punten van flowcytometrie is. Hiermee kunnen onderzoekers in één experiment tegelijkertijd meerdere celkenmerken beoordelen, zoals oppervlaktemarkers, intracellulaire eiwitten en DNA-inhoud. Zonder de juiste fixatie kunnen de verkregen gegevens inconsistent of onvolledig zijn, wat leidt tot een verkeerde interpretatie van de experimentele resultaten.
Soorten fixatiemethoden voor flowcytometrie
Paraformaldehyde (PFA) fixatie
Paraformaldehyde (PFA) is een van de meest gebruikte fixeermiddelen in flowcytometrie, voornamelijk vanwege de effectiviteit ervan bij het behouden van celmorfologie en antigeniciteit. Het werkt door eiwitten in de cellen te verknopen, waardoor zowel de cellulaire structuur als de oppervlakte-eiwitten intact blijven. Dit maakt PFA een uitstekende keuze voor het behoud van celoppervlaktemarkers, vooral bij het analyseren van oppervlakte-eiwitexpressie in immunofenotyperingsexperimenten.
Aanbeveling:
● Concentratie: 2-4% PFA wordt gewoonlijk gebruikt voor optimale fixatie.
● Fixatietijd: Cellen moeten gedurende 15-30 minuten bij 2-8°C in PFA worden geïncubeerd.
● Opslag: Na fixatie moeten de cellen bij 2-8°C worden bewaard voor kortetermijnopslag. Het is belangrijk om vaste cellen niet gedurende langere perioden op te slaan, omdat dit kan leiden tot verlies van markerintegriteit.
Het is belangrijk om overfixatie te voorkomen, omdat langdurige blootstelling aan PFA kan leiden tot cellulaire autofluorescentie en de daaropvolgende kleuring en analyse kan verstoren. Gebruik altijd de minimaal benodigde hoeveelheid tijd voor fixatie.
Ethanolfixatie
Ethanolfixatie wordt vaak gebruikt wanneer de focus van de analyse ligt op het DNA-gehalte, zoals bij celcyclusstudies. Ethanol is een dehydraterend middel dat werkt door het celmembraan te penetreren en het DNA in de cellen te behouden. Dit maakt ethanolfixatie bijzonder nuttig voor op DNA gebaseerde tests en flowcytometrieanalyses waarbij celcyclusstadia of DNA-inhoud worden onderzocht.
Aanbeveling:
● Concentratie: Normaal gesproken wordt 70-100% ethanol gebruikt.
● Fixatietijd: Fixatie op ethanol vereist doorgaans 10-15 minuten voor optimale resultaten.
Ethanolfixatie is ideaal voor het behoud van celcyclusfasen en kan worden gebruikt in combinatie met DNA-bindende kleurstoffen zoals propidiumjodide (PI) voor celcyclusanalyse.
Methanolfixatie
Methanol is een ander veelgebruikt fixeermiddel, vooral voor intracellulaire analyses. Het werkt door het celmembraan te penetreren en de interne structuren van de cel te stabiliseren. Hoewel methanol effectief is bij het behoud van cellulaire eiwitten en antigenen, kan het celkrimp veroorzaken, wat van invloed kan zijn op de interpretatie van bepaalde kenmerken, zoals celgrootte en morfologie.
Aanbeveling:
● Concentratie: Normaal gesproken wordt 90-100% methanol gebruikt.
● Fixatietijd: 10-15 minuten is doorgaans voldoende.
Methanolfixatie wordt vaak gebruikt bij het bestuderen van intracellulaire eiwitten, vooral bij het onderzoeken van markers in het cytoplasma of de kern. Onderzoekers moeten echter rekening houden met het potentieel voor celkrimp bij gebruik van methanolfixatie.
Andere fixeermiddelen (bijv. Formaline)
Formaline, een oplossing van formaldehyde in water, is een ander fixeermiddel dat wordt gebruikt bij flowcytometrie, hoewel het minder vaak voorkomt dan PFA. Formaline wordt veel gebruikt in de histologie en immunohistochemie, waar het weefselmonsters effectief bewaart voor microscopische analyse. Hoewel formaline celstructuren kan behouden, wordt het over het algemeen niet aanbevolen voor flowcytometrie, tenzij met vaste weefselmonsters wordt gewerkt, omdat het de celsortering en sommige fluorescentietoepassingen kan verstoren. Formalinefixatie is het meest geschikt voor weefselmonsters, niet voor individuele cellen.
Fixatief |
Concentratie |
Fixatie tijd |
Aanbevolen gebruik |
Paraformaldehyde (PFA) |
2-4% |
15-30 minuten |
Ideaal voor het conserveren van celoppervlaktemarkers; gebruikelijk bij immunofenotypering |
Ethanol |
70-100% |
10-15 minuten |
Beste voor DNA-inhoudsanalyse en celcyclusstudies |
Methanol |
90-100% |
10-15 minuten |
Geschikt voor intracellulaire eiwitanalyse; kan celkrimp veroorzaken |
Formaline |
10% (formaldehyde) |
Varieert (afhankelijk van weefsel) |
Over het algemeen gebruikt voor vaste weefselmonsters, niet voor individuele cellen |
Stapsgewijze handleiding voor het repareren van cellen voor flowcytometrie
Het celmonster voorbereiden
Vóór fixatie is het essentieel om de cellen uit het weefsel- of bloedmonster te isoleren. Centrifugeren is de meest gebruikte methode voor het concentreren van cellen in een suspensie. Het is ook van cruciaal belang om de cellen grondig te wassen om eventuele kweekmedia of resterende verontreinigingen te verwijderen die het fixatieproces kunnen verstoren.
1. Celisolatie: Gebruik standaard isolatiemethoden zoals centrifugatie of celsortering om de cellen van belang te scheiden.
2. Wassen: Was de cellen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om resterende media en verontreinigingen te verwijderen die het fixatieproces kunnen beïnvloeden.
Fixatieprocedure
Zodra de cellen zijn voorbereid, is de volgende stap het toevoegen van het fixeermiddel aan de celsuspensie. Het meest gebruikte fixeermiddel voor flowcytometrie is een 2-4% PFA-oplossing.
1. Voeg het fixeermiddel toe aan de celsuspensie en zorg ervoor dat het goed gemengd is.
2. Incubeer de cellen met het fixeermiddel gedurende 15-30 minuten bij 2-8°C.
3. Was de cellen na de incubatie tweemaal met PBS om overtollig fixeermiddel te verwijderen.
Stappen na fixatie
Na fixatie moeten de cellen voorzichtig worden behandeld. Als verdere analyse nodig is, moeten de cellen vóór analyse worden gekleurd. Als u van plan bent de cellen op te slaan voor toekomstige analyse, resuspendeer ze dan in een geschikte buffer en bewaar ze bij 2-8°C. Vermijd het langdurig in het fixeermiddel laten van cellen, omdat overfixatie kan leiden tot verhoogde autofluorescentie en verminderde signaalkwaliteit.
Tips voor optimale fixatie bij flowcytometrie
Overfixatie vermijden
Overfixatie treedt op wanneer cellen te lang aan het fixeermiddel worden blootgesteld, wat kan resulteren in overmatige verknoping van cellulaire eiwitten en de kwaliteit van de gegevens in gevaar kan brengen. Dit kan leiden tot autofluorescentie, verminderde antilichaambinding en onnauwkeurige flowcytometriemetingen. Controleer altijd de aanbevolen fixatietijden voor uw specifieke celtype en experimenteer om overfixatie te voorkomen.
Fixatietijd versus monstertype
De optimale fixatietijd kan variëren afhankelijk van het celtype en de aard van het experiment. Immuuncellen kunnen bijvoorbeeld kortere fixatietijden nodig hebben dan weefselmonsters. Pas de fixatietijd aan op basis van de specifieke behoeften van het monstertype. Voor oppervlakte-eiwitanalyse is doorgaans een kortere fixatietijd (10-15 minuten) voldoende. Voor intracellulaire kleuring of DNA-analyse kan een langere fixatietijd nodig zijn.
Verkleuring na fixatie
Na het fixeren van de cellen is kleuring met antilichamen of fluorescerende kleurstoffen een cruciale stap in de flowcytometrieanalyse. Sommige fluorescerende kleurstoffen, met name tandemkleurstoffen, kunnen gevoelig zijn voor fixatie en kunnen verslechteren als de cellen te veel worden gefixeerd. Voor optimale kleurresultaten wordt aanbevolen om de cellen indien mogelijk vóór fixatie te kleuren. Dit kan de afbraak van de kleurstof helpen voorkomen en zorgen voor sterkere fluorescentiesignalen.
Vaste cellen opslaan voor flowcytometrie
Kortetermijnopslag
Voor kortetermijnopslag kunnen vaste cellen in de koelkast bij 2-8°C worden bewaard. Dit is ideaal als u van plan bent de cellen binnen een dag of twee na fixatie te analyseren. Bewaar vaste cellen altijd in het donker om fotobleken te voorkomen, wat de fluorescentiesignalen kan beïnvloeden.
Langetermijnopslag
Voor langdurige opslag kunnen cellen worden ingevroren in cryopreservatiemedia. Een typisch cryopreservatiemedium bestaat uit 10% dimethylsulfoxide (DMSO) en 90% foetaal runderserum (FBS). Er zijn echter ook serumvrije cryopreservatieoplossingen zoals mFreSR™ of CryoStor™ CS10 beschikbaar en deze kunnen worden gebruikt om problemen in verband met FBS te voorkomen. Om de vorming van ijskristallen te voorkomen, gebruikt u een vriezer met gecontroleerde snelheid om de cellen te bevriezen. Dit helpt de levensvatbaarheid van de cellen te behouden en zorgt voor een goede opslag.
Veel voorkomende valkuilen die u moet vermijden bij celfixatie voor flowcytometrie
Effecten van onjuiste fixatie
Onjuiste fixatie kan tot verschillende problemen leiden, waaronder autofluorescentie, verminderde antilichaambinding en slechte levensvatbaarheid van de cellen. Deze problemen kunnen de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van flowcytometrieresultaten aanzienlijk beïnvloeden. Controleer altijd de fixatieprotocollen voor uw specifieke monstertype en zorg ervoor dat de fixatieomstandigheden geschikt zijn voor het celtype en de markers die worden geanalyseerd.
Het juiste fixatief voor uw toepassing kiezen
Het kiezen van het juiste fixeermiddel voor uw flowcytometrie-experiment is cruciaal voor het verkrijgen van betrouwbare en nauwkeurige resultaten. Verschillende fixatieven zijn beter geschikt voor verschillende toepassingen. PFA wordt bijvoorbeeld vaak gebruikt voor de analyse van oppervlakte-eiwitten, terwijl ethanol ideaal is voor DNA-gebaseerde onderzoeken. Onderzoek voordat u met het experiment begint het beste fixeermiddel voor uw specifieke toepassing en pas het fixatieprotocol dienovereenkomstig aan.
Conclusie
Een goede celfixatie is essentieel voor het bereiken van een succesvolle flowcytometrieanalyse. Het helpt de celstructuren te behouden en zorgt voor de integriteit van eiwitten en DNA. Door de juiste fixatieprotocollen te volgen en overfixatie te vermijden, kunnen onderzoekers de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de gegevens verbeteren. Als u het juiste fixeermiddel voor uw experiment selecteert, verbetert u de algehele kwaliteit van uw resultaten. Het implementeren van deze best practices zorgt ervoor dat uw flowcytometrieanalyse consistente, reproduceerbare inzichten in cellulaire functies biedt.
Een goede celfixatie speelt een sleutelrol bij flowcytometrie en producten daarvan HKeybio biedt betrouwbare oplossingen. Hun aanbod garandeert resultaten van hoge kwaliteit en wordt door onderzoekers over de hele wereld vertrouwd voor nauwkeurige celanalyse.
Veelgestelde vragen
Vraag: Wat is het belang van celfixatie bij flowcytometrie?
A: Celfixatie is cruciaal bij flowcytometrie omdat het de cellulaire structuren behoudt en de integriteit van eiwitten en DNA garandeert voor nauwkeurige analyse.
Vraag: Hoe lang moeten cellen worden gefixeerd voor flowcytometrie?
A: Cellen moeten doorgaans gedurende 15-30 minuten worden gefixeerd met een 2-4% paraformaldehyde (PFA)-oplossing om de cellulaire integriteit te behouden.
Vraag: Kan ik ethanol gebruiken voor celfixatie bij flowcytometrie?
A: Ja, ethanolfixatie wordt vaak gebruikt voor analyse van het DNA-gehalte bij flowcytometrie, vooral voor celcyclusstudies.
Vraag: Wat gebeurt er als cellen te veel gefixeerd zijn in flowcytometrie?
A: Overmatige fixatie kan overmatige verknoping veroorzaken, wat leidt tot autofluorescentie en slechte antilichaambinding, wat de resultaten van de flowcytometrie kan beïnvloeden.
