Indledning
Har du nogensinde spekuleret på hvordan flowcytometri opnår en så præcis og pålidelig celleanalyse? Nøglen til nøjagtige resultater ligger i korrekt cellefiksering. Flowcytometri giver forskere mulighed for at studere en række cellulære karakteristika, fra størrelse til fluorescensintensitet. Uden korrekt fiksering afspejler dataene muligvis ikke ægte cellulære egenskaber. I denne artikel vil vi udforske vigtigheden af cellefiksering i flowcytometri, diskutere forskellige fikseringsmetoder og dele tips til optimale resultater.
Hvad er cellefiksering i flowcytometri?
Definition af cellefiksering
Cellefiksering er en proces, der stabiliserer og bevarer cellerne ved at forhindre ændringer i deres struktur, funktion og molekylære sammensætning. Denne proces opnås ved kemisk at tværbinde proteiner, lipider og andre cellulære komponenter, der effektivt 'fryser' cellerne i deres nuværende tilstand. Dette er særligt vigtigt i flowcytometri, fordi det forhindrer nedbrydning af cellulære markører eller ændring af cellulære strukturer under analysen. Ved at fiksere cellerne kan forskerne sikre, at cellernes egenskaber forbliver konsistente, hvilket giver mulighed for præcise målinger og pålidelige data under flowcytometrianalyse.
Hvorfor fiksering er vigtig
Korrekt fiksering er afgørende, fordi det opretholder integriteten af cellulære proteiner og nukleinsyrer, som er afgørende for nøjagtig flowcytometrianalyse. Hvis celler ikke er fikseret, kan deres struktur og molekylære markører nedbrydes eller ændre sig over tid, hvilket fører til upålidelige og unøjagtige resultater. Fiksering spiller også en kritisk rolle i stabilisering af celler til multi-parameter analyse, hvilket er en af de vigtigste styrker ved flowcytometri. Det giver forskere mulighed for samtidigt at vurdere flere celletræk, såsom overflademarkører, intracellulære proteiner og DNA-indhold, i et enkelt eksperiment. Uden korrekt fiksering kan de opnåede data være inkonsistente eller ufuldstændige, hvilket fører til fejlfortolkning af de eksperimentelle resultater.
Typer af fikseringsmetoder til flowcytometri
Paraformaldehyd (PFA) fiksering
Paraformaldehyd (PFA) er et af de mest udbredte fikseringsmidler i flowcytometri, primært på grund af dets effektivitet til at bevare cellemorfologi og antigenicitet. Det virker ved at tværbinde proteiner i cellerne, hvilket sikrer, at både den cellulære struktur og overfladeproteiner forbliver intakte. Dette gør PFA til et glimrende valg til bevarelse af celleoverflademarkører, især når man analyserer overfladeproteinekspression i immunfænotypningseksperimenter.
Henstilling:
● Koncentration: 2-4% PFA bruges almindeligvis til optimal fiksering.
● Fikseringstid: Celler bør inkuberes i PFA i 15-30 minutter ved 2-8°C.
● Opbevaring: Efter fiksering skal celler opbevares ved 2-8°C til korttidsopbevaring. Det er vigtigt ikke at opbevare fikserede celler i længere perioder, da dette kan føre til tab af markørintegritet.
Det er vigtigt at undgå overfiksering, da langvarig eksponering for PFA kan føre til cellulær autofluorescens og interferere med efterfølgende farvning og analyse. Brug altid den minimale nødvendige tid til fiksering.
Ethanol fiksering
Ethanolfiksering er almindeligt anvendt, når fokus i analysen er på DNA-indhold, såsom i cellecyklusundersøgelser. Ethanol er et dehydrerende middel, der virker ved at trænge ind i cellemembranen og bevare DNA'et i cellerne. Dette gør ethanolfiksering særlig nyttig til DNA-baserede analyser og flowcytometrianalyser, hvor cellecyklusstadier eller DNA-indhold undersøges.
Henstilling:
● Koncentration: Typisk anvendes 70-100 % ethanol.
● Fikseringstid: Ethanolfiksering kræver typisk 10-15 minutter for optimale resultater.
Ethanolfiksering er ideel til at bevare cellecyklusfaser, og den kan bruges i kombination med DNA-bindende farvestoffer såsom propidiumiodid (PI) til cellecyklusanalyse.
Methanolfiksering
Methanol er et andet almindeligt anvendt fikseringsmiddel, især til intracellulære analyser. Det virker ved at trænge ind i cellemembranen og stabilisere cellens indre strukturer. Mens methanol er effektivt til at bevare cellulære proteiner og antigener, kan det forårsage cellekrympning, hvilket kan påvirke fortolkningen af visse funktioner, såsom cellestørrelse og morfologi.
Henstilling:
● Koncentration: Typisk anvendes 90-100 % methanol.
● Fikseringstid: 10-15 minutter er normalt tilstrækkeligt.
Methanolfiksering bruges ofte, når man studerer intracellulære proteiner, især når man undersøger markører inde i cytoplasmaet eller kernen. Forskere bør dog overveje potentialet for cellekrympning, når de bruger methanolfiksering.
Andre fikseringsmidler (f.eks. formalin)
Formalin, en opløsning af formaldehyd i vand, er et andet fikseringsmiddel, der bruges i flowcytometri, selvom det er mindre almindeligt end PFA. Formalin er meget udbredt i histologi og immunhistokemi, hvor det effektivt bevarer vævsprøver til mikroskopisk analyse. Selvom formalin kan bevare cellestrukturer, anbefales det generelt ikke til flowcytometri, medmindre der arbejdes med faste vævsprøver, da det kan interferere med cellesortering og nogle fluorescensapplikationer. Formalinfiksering er bedst egnet til vævsprøver, ikke til individuelle celler.
Fixativ |
Koncentration |
Fikseringstid |
Anbefalet brug |
Paraformaldehyd (PFA) |
2-4 % |
15-30 minutter |
Ideel til at bevare celleoverflademarkører; fælles for immunfænotyping |
Ethanol |
70-100 % |
10-15 minutter |
Bedst til DNA-indholdsanalyse og cellecyklusundersøgelser |
methanol |
90-100 % |
10-15 minutter |
Velegnet til intracellulær proteinanalyse; kan forårsage cellekrympning |
Formalin |
10% (formaldehyd) |
Varierer (afhænger af væv) |
Anvendes generelt til fikserede vævsprøver, ikke til individuelle celler |
Trin-for-trin guide til fiksering af celler til flowcytometri
Forberedelse af celleprøven
Før fiksering er det vigtigt at isolere cellerne fra vævs- eller blodprøven. Centrifugering er den mest almindelige metode, der bruges til at koncentrere celler i en suspension. Det er også afgørende at vaske cellerne grundigt for at fjerne eventuelle dyrkningsmedier eller resterende kontaminanter, som kan forstyrre fikseringsprocessen.
1. Celleisolering: Brug standardisoleringsmetoder såsom centrifugering eller cellesortering til at adskille cellerne af interesse.
2. Vask: Vask cellerne med fosfatpufret saltvand (PBS) for at fjerne resterende medier og kontaminanter, der kan påvirke fikseringsprocessen.
Fikseringsprocedure
Når cellerne er forberedt, er det næste trin at tilføje fikseringsmidlet til cellesuspensionen. Det mest almindeligt anvendte fikseringsmiddel til flowcytometri er en 2-4 % PFA-opløsning.
1. Tilføj fikseringsmidlet til cellesuspensionen, og sørg for, at det er godt blandet.
2. Inkuber cellerne med fikseringsmidlet i 15-30 minutter ved 2-8°C.
3. Efter inkubationen vaskes cellerne to gange med PBS for at fjerne overskydende fikseringsmiddel.
Trin efter fiksering
Efter fiksering skal cellerne håndteres forsigtigt. Hvis yderligere analyse er nødvendig, skal cellerne farves før analyse. Hvis du planlægger at opbevare cellerne til fremtidig analyse, skal du resuspendere dem i en passende buffer og opbevare dem ved 2-8°C. Undgå at efterlade celler i fikseringsmidlet i lange perioder, da overfiksering kan føre til øget autofluorescens og reduceret signalkvalitet.
Tips til optimal fiksering i flowcytometri
Undgå overfiksering
Overfiksering opstår, når celler udsættes for fikseringsmidlet for længe, hvilket kan resultere i overdreven tværbinding af cellulære proteiner og kompromittere kvaliteten af dataene. Dette kan føre til autofluorescens, reduceret antistofbinding og unøjagtige flowcytometrimålinger. Kontroller altid de anbefalede fikseringstider for din specifikke celletype og eksperiment for at undgå overfiksering.
Fikseringstid vs. prøvetype
Den optimale fikseringstid kan variere afhængigt af celletypen og eksperimentets art. For eksempel kan immunceller kræve kortere fikseringstider end vævsprøver. Juster fikseringstiden baseret på de specifikke behov for prøvetypen. Til overfladeproteinanalyse er en kortere fikseringstid (10-15 minutter) normalt tilstrækkelig. Til intracellulær farvning eller DNA-analyse kan en længere fikseringstid være påkrævet.
Farvning efter fiksering
Efter fiksering af cellerne er farvning med antistoffer eller fluorescerende farvestoffer et kritisk trin i flowcytometrianalyse. Nogle fluorescerende farvestoffer, især tandemfarvestoffer, kan være følsomme over for fiksering og kan nedbrydes, hvis cellerne er overfikserede. For at opnå optimale farvningsresultater anbefales det at farve cellerne før fiksering, når det er muligt. Dette kan hjælpe med at forhindre nedbrydning af farvestof og sikre stærkere fluorescenssignaler.
Lagring af faste celler til flowcytometri
Korttidsopbevaring
Til korttidsopbevaring kan fikserede celler opbevares i køleskabet ved 2-8°C. Dette er ideelt, når du planlægger at analysere cellerne inden for en dag eller to efter fiksering. Opbevar altid faste celler i mørke for at forhindre fotoblegning, som kan påvirke de fluorescerende signaler.
Langtidsopbevaring
Til langtidsopbevaring kan cellerne fryses i kryokonserveringsmedier. Et typisk kryokonserveringsmedium består af 10 % dimethylsulfoxid (DMSO) og 90 % føtalt bovint serum (FBS). Serumfrie kryokonserveringsløsninger som mFreSR™ eller CryoStor™ CS10 er dog også tilgængelige og kan bruges til at undgå problemer forbundet med FBS. For at forhindre iskrystaldannelse skal du bruge en fryser med kontrolleret hastighed til at fryse cellerne. Dette hjælper med at opretholde cellelevedygtighed og sikrer korrekt opbevaring.
Almindelige faldgruber, der skal undgås ved cellefiksering til flowcytometri
Virkninger af forkert fiksering
Forkert fiksering kan føre til flere problemer, herunder autofluorescens, reduceret antistofbinding og dårlig cellelevedygtighed. Disse problemer kan i væsentlig grad påvirke nøjagtigheden og pålideligheden af flowcytometriresultater. Kontroller altid fikseringsprotokoller for din specifikke prøvetype, og sørg for, at fikseringsbetingelserne er passende for den celletype og markører, der analyseres.
Valg af det rigtige fikseringsmiddel til din applikation
At vælge det passende fikseringsmiddel til dit flowcytometrieksperiment er afgørende for at opnå pålidelige og nøjagtige resultater. Forskellige fikseringsmidler er bedre egnede til forskellige applikationer. For eksempel er PFA almindeligvis brugt til overfladeproteinanalyse, mens ethanol er ideel til DNA-baserede undersøgelser. Inden du starter eksperimentet, skal du undersøge det bedste fikseringsmiddel til din specifikke anvendelse og justere fikseringsprotokollen i overensstemmelse hermed.
Konklusion
Korrekt cellefiksering er afgørende for at opnå vellykket flowcytometrianalyse. Det hjælper med at bevare cellulære strukturer og sikrer integriteten af proteiner og DNA. Ved at følge korrekte fikseringsprotokoller og undgå overfiksering kan forskere øge datanøjagtigheden og pålideligheden. Valg af det passende fikseringsmiddel til dit eksperiment forbedrer den overordnede kvalitet af dine resultater. Implementering af disse bedste praksisser sikrer, at din flowcytometrianalyse giver ensartet, reproducerbar indsigt i cellulære funktioner.
Korrekt cellefiksering spiller en nøglerolle i flowcytometri, og produkter fra HKeybio tilbyder pålidelige løsninger. Deres tilbud sikrer resultater af høj kvalitet og er betroet af forskere verden over for nøjagtig celleanalyse.
FAQ
Q: Hvad er vigtigheden af cellefiksering i flowcytometri?
Sv: Cellefiksering er afgørende i flowcytometri, da det bevarer cellulære strukturer og sikrer integriteten af proteiner og DNA til nøjagtig analyse.
Q: Hvor længe skal celler fikseres til flowcytometri?
A: Celler bør typisk fikseres i 15-30 minutter med en 2-4% paraformaldehyd (PFA) opløsning for at opretholde cellulær integritet.
Q: Kan jeg bruge ethanol til cellefiksering i flowcytometri?
A: Ja, ethanolfiksering bruges almindeligvis til DNA-indholdsanalyse i flowcytometri, især til cellecyklusundersøgelser.
Q: Hvad sker der, hvis celler er overfikseret i flowcytometri?
A: Overfiksering kan forårsage overdreven tværbinding, hvilket fører til autofluorescens og dårlig antistofbinding, hvilket kan påvirke flowcytometriresultater.
