Introducere
Te-ai întrebat vreodată cum citometria în flux realizează o astfel de analiză celulară precisă și fiabilă? Cheia pentru rezultate precise constă în fixarea corectă a celulelor. Citometria în flux permite cercetătorilor să studieze o varietate de caracteristici celulare, de la dimensiune la intensitatea fluorescenței. Cu toate acestea, fără o fixare adecvată, este posibil ca datele să nu reflecte proprietățile celulare adevărate. În acest articol, vom explora importanța fixării celulelor în citometria în flux, vom discuta despre diferite metode de fixare și vom împărtăși sfaturi pentru rezultate optime.
Ce este fixarea celulară în citometria în flux?
Definiția Cell Fixation
Fixarea celulară este un proces care stabilizează și păstrează celulele prin prevenirea modificărilor în structura, funcția și compoziția moleculară a acestora. Acest proces este realizat prin legarea chimică a proteinelor, lipidelor și a altor componente celulare, „înghețând” efectiv celulele în starea lor actuală. Acest lucru este deosebit de important în citometria în flux, deoarece previne degradarea markerilor celulari sau alterarea structurilor celulare în timpul analizei. Prin fixarea celulelor, cercetătorii se pot asigura că caracteristicile celulelor rămân consistente, ceea ce permite măsurători precise și date fiabile în timpul analizei citometriei în flux.
De ce este importantă fixarea
Fixarea corectă este esențială, deoarece menține integritatea proteinelor celulare și a acizilor nucleici, care sunt cruciale pentru analiza citometriei în flux precisă. Dacă celulele nu sunt fixate, structura și markerii lor moleculari se pot degrada sau modifica în timp, ceea ce duce la rezultate nesigure și inexacte. Fixarea joacă, de asemenea, un rol critic în stabilizarea celulelor pentru analiza multi-parametrică, care este unul dintre punctele forte cheie ale citometriei în flux. Acesta permite cercetătorilor să evalueze simultan mai multe caracteristici celulare, cum ar fi markerii de suprafață, proteinele intracelulare și conținutul de ADN, într-un singur experiment. Fără o fixare adecvată, datele obținute ar putea fi inconsecvente sau incomplete, ceea ce duce la interpretarea greșită a rezultatelor experimentale.
Tipuri de metode de fixare pentru citometria în flux
Fixare cu paraformaldehidă (PFA).
Paraformaldehida (PFA) este unul dintre cei mai folosiți fixativi în citometria în flux, în primul rând datorită eficacității sale în păstrarea morfologiei și antigenicității celulare. Funcționează prin legarea încrucișată a proteinelor din interiorul celulelor, asigurând că atât structura celulară, cât și proteinele de suprafață rămân intacte. Acest lucru face ca PFA să fie o alegere excelentă pentru păstrarea markerilor de suprafață celulară, în special atunci când se analizează expresia proteinelor de suprafață în experimentele de imunofenotipizare.
Recomandare:
● Concentrație: 2-4% PFA este utilizat în mod obișnuit pentru fixarea optimă.
● Timp de fixare: Celulele trebuie incubate în PFA timp de 15-30 minute la 2-8°C.
● Depozitare: După fixare, celulele trebuie păstrate la 2-8°C pentru depozitare pe termen scurt. Este important să nu depozitați celulele fixe pentru perioade lungi, deoarece acest lucru poate duce la pierderea integrității markerului.
Este important să se evite suprafixarea, deoarece expunerea prelungită la PFA poate duce la autofluorescență celulară și poate interfera cu colorarea și analiza ulterioară. Utilizați întotdeauna timpul minim necesar pentru fixare.
Fixare cu etanol
Fixarea etanolului este folosită în mod obișnuit atunci când se concentrează analizele pe conținutul de ADN, cum ar fi în studiile ciclului celular. Etanolul este un agent de deshidratare care acționează prin penetrarea membranei celulare și păstrarea ADN-ului din celule. Acest lucru face ca fixarea etanolului să fie deosebit de utilă pentru testele bazate pe ADN și analizele de citometrie în flux în care sunt examinate etapele ciclului celular sau conținutul de ADN.
Recomandare:
● Concentrație: De obicei, se utilizează 70-100% etanol.
● Timp de fixare: fixarea cu etanol necesită de obicei 10-15 minute pentru rezultate optime.
Fixarea etanolului este ideală pentru păstrarea fazelor ciclului celular și poate fi utilizată în combinație cu coloranți care leagă ADN-ul, cum ar fi iodura de propidiu (PI) pentru analiza ciclului celular.
Fixarea metanolului
Metanolul este un alt fixativ utilizat în mod obișnuit, în special pentru analizele intracelulare. Funcționează prin penetrarea membranei celulare și stabilizarea structurilor interne ale celulei. În timp ce metanolul este eficient în conservarea proteinelor celulare și a antigenelor, poate provoca contracția celulelor, ceea ce ar putea afecta interpretarea anumitor caracteristici, cum ar fi dimensiunea și morfologia celulei.
Recomandare:
● Concentrație: de obicei, se utilizează 90-100% metanol.
● Timp de fixare: 10-15 minute sunt de obicei suficiente.
Fixarea metanolului este adesea folosită atunci când se studiază proteinele intracelulare, în special când se examinează markerii din interiorul citoplasmei sau nucleului. Cu toate acestea, cercetătorii ar trebui să ia în considerare potențialul de contracție celulară atunci când se utilizează fixarea metanolului.
Alte fixative (de exemplu, formol)
Formalina, o soluție de formaldehidă în apă, este un alt fixativ utilizat în citometria în flux, deși este mai puțin comun decât PFA. Formalina este utilizată pe scară largă în histologie și imunohistochimie, unde păstrează eficient probele de țesut pentru analiza microscopică. Deși formalina poate păstra structurile celulare, în general nu este recomandată pentru citometria în flux decât dacă se lucrează cu mostre de țesut fixe, deoarece poate interfera cu sortarea celulelor și cu unele aplicații de fluorescență. Fixarea cu formol este cea mai potrivită pentru mostre de țesut, nu pentru celule individuale.
Fixativ |
Concentraţie |
Timp de fixare |
Utilizare recomandată |
Paraformaldehidă (PFA) |
2-4% |
15-30 minute |
Ideal pentru păstrarea markerilor de suprafață celulară; comune pentru imunofenotipizare |
Etanol |
70-100% |
10-15 minute |
Cel mai bun pentru analiza conținutului de ADN și studiile ciclului celular |
metanol |
90-100% |
10-15 minute |
Potrivit pentru analiza proteinelor intracelulare; poate provoca contracția celulară |
Formol |
10% (formaldehidă) |
Variază (depinde de țesut) |
Utilizat în general pentru mostre de țesut fixe, nu pentru celule individuale |
Ghid pas cu pas pentru fixarea celulelor pentru citometria în flux
Pregătirea probei celulare
Înainte de fixare, este esențial să izolați celulele din țesut sau din proba de sânge. Centrifugarea este cea mai comună metodă utilizată pentru concentrarea celulelor într-o suspensie. De asemenea, este esențial să spălați bine celulele pentru a îndepărta orice mediu de cultură sau contaminanți reziduali, care ar putea interfera cu procesul de fixare.
1. Izolarea celulelor: Utilizați metode standard de izolare, cum ar fi centrifugarea sau sortarea celulelor pentru a separa celulele de interes.
2. Spălare: Spălați celulele cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) pentru a îndepărta mediile reziduale și contaminanții care ar putea afecta procesul de fixare.
Procedura de fixare
Odată ce celulele sunt pregătite, următorul pas este adăugarea fixativului la suspensia celulară. Cel mai frecvent utilizat fixativ pentru citometria în flux este o soluție de PFA 2-4%.
1. Adăugați fixativul în suspensia celulară, asigurându-vă că este bine amestecat.
2. Se incubează celulele cu fixativ timp de 15-30 minute la 2-8°C.
3. După incubare, se spală celulele de două ori cu PBS pentru a îndepărta excesul de fixator.
Etape post-fixare
După fixare, celulele trebuie manipulate cu grijă. Dacă sunt necesare analize suplimentare, celulele trebuie colorate înainte de analiză. Dacă intenționați să stocați celulele pentru analize viitoare, resuspendați-le într-un tampon adecvat și păstrați-le la 2-8°C. Evitați să lăsați celulele în fixativ pentru perioade lungi, deoarece suprafixarea poate duce la creșterea autofluorescenței și la o calitate redusă a semnalului.
Sfaturi pentru fixarea optimă în citometria în flux
Evitarea suprafixării
Supra-fixarea are loc atunci când celulele sunt expuse la fixativ pentru prea mult timp, ceea ce poate duce la o reticulare excesivă a proteinelor celulare și poate compromite calitatea datelor. Acest lucru poate duce la autofluorescență, legare redusă de anticorpi și măsurători inexacte prin citometrie în flux. Verificați întotdeauna timpii de fixare recomandati pentru tipul dvs. specific de celulă și experimentați pentru a evita fixarea excesivă.
Timpul de fixare vs. tipul eșantionului
Timpul optim de fixare poate varia în funcție de tipul de celulă și de natura experimentului. De exemplu, celulele imune pot necesita timpi de fixare mai scurti decât probele de țesut. Reglați timpul de fixare în funcție de nevoile specifice ale tipului de eșantion. Pentru analiza proteinelor de suprafață, un timp de fixare mai scurt (10-15 minute) este de obicei suficient. Pentru colorarea intracelulară sau analiza ADN-ului, poate fi necesar un timp de fixare mai lung.
Colorarea după fixare
După fixarea celulelor, colorarea cu anticorpi sau coloranți fluorescenți este o etapă critică în analiza citometriei în flux. Unii coloranți fluorescenți, în special coloranții tandem, pot fi sensibili la fixare și se pot degrada dacă celulele sunt suprafixate. Pentru rezultate optime de colorare, se recomandă colorarea celulelor înainte de fixare ori de câte ori este posibil. Acest lucru poate ajuta la prevenirea degradării coloranților și la asigurarea unor semnale de fluorescență mai puternice.
Stocarea celulelor fixe pentru citometrie în flux
Depozitare pe termen scurt
Pentru depozitare pe termen scurt, celulele fixe pot fi păstrate la frigider la 2-8°C. Acest lucru este ideal atunci când intenționați să analizați celulele într-o zi sau două după fixare. Depozitați întotdeauna celulele fixe în întuneric pentru a preveni fotoalbirea, care poate afecta semnalele fluorescente.
Depozitare pe termen lung
Pentru depozitarea pe termen lung, celulele pot fi congelate în medii de crioconservare. Un mediu de crioconservare tipic constă din 10% dimetil sulfoxid (DMSO) și 90% ser fetal bovin (FBS). Cu toate acestea, sunt disponibile și soluții de crioconservare fără ser, cum ar fi mFreSR™ sau CryoStor™ CS10, care pot fi utilizate pentru a evita problemele asociate cu FBS. Pentru a preveni formarea de cristale de gheață, utilizați un congelator cu viteză controlată pentru a îngheța celulele. Acest lucru ajută la menținerea viabilității celulare și asigură o depozitare adecvată.
Capcanele obișnuite de evitat în fixarea celulară pentru citometria în flux
Efectele fixării necorespunzătoare
Fixarea necorespunzătoare poate duce la mai multe probleme, inclusiv autofluorescența, legarea redusă a anticorpilor și viabilitatea celulară slabă. Aceste probleme pot afecta în mod semnificativ acuratețea și fiabilitatea rezultatelor citometriei în flux. Verificați întotdeauna protocoalele de fixare pentru tipul dvs. specific de probă și asigurați-vă că condițiile de fixare sunt adecvate pentru tipul de celulă și markerii analizați.
Alegerea fixativului potrivit pentru aplicația dvs
Alegerea fixativului potrivit pentru experimentul dumneavoastră de citometrie în flux este crucială pentru obținerea unor rezultate fiabile și precise. Diferiții fixativi sunt mai potriviti pentru diferite aplicații. De exemplu, PFA este utilizat în mod obișnuit pentru analiza proteinelor de suprafață, în timp ce etanolul este ideal pentru studiile bazate pe ADN. Înainte de a începe experimentul, căutați cel mai bun fixativ pentru aplicația dvs. specifică și ajustați protocolul de fixare în consecință.
Concluzie
Fixarea corectă a celulelor este esențială pentru realizarea cu succes a analizei citometriei în flux. Ajută la conservarea structurilor celulare și asigură integritatea proteinelor și ADN-ului. Urmând protocoalele de fixare adecvate și evitând suprafixarea, cercetătorii pot îmbunătăți acuratețea și fiabilitatea datelor. Selectarea fixativului potrivit pentru experimentul dvs. îmbunătățește calitatea generală a rezultatelor dvs. Implementarea acestor bune practici asigură că analiza citometriei în flux oferă informații consistente și reproductibile asupra funcțiilor celulare.
Fixarea corectă a celulelor joacă un rol cheie în citometria în flux și a produselor din HKeybio oferă soluții de încredere. Ofertele lor asigură rezultate de înaltă calitate și sunt de încredere de către cercetătorii din întreaga lume pentru o analiză precisă a celulelor.
FAQ
Î: Care este importanța fixării celulelor în citometria în flux?
R: Fixarea celulară este crucială în citometria în flux, deoarece păstrează structurile celulare și asigură integritatea proteinelor și ADN-ului pentru o analiză precisă.
Î: Cât timp ar trebui să fie fixate celulele pentru citometria în flux?
R: Celulele ar trebui de obicei fixate timp de 15-30 de minute cu o soluție de paraformaldehidă (PFA) 2-4% pentru a menține integritatea celulară.
Î: Pot folosi etanol pentru fixarea celulelor în citometria în flux?
R: Da, fixarea cu etanol este folosită în mod obișnuit pentru analiza conținutului de ADN în citometria în flux, în special pentru studiile ciclului celular.
Î: Ce se întâmplă dacă celulele sunt supra-fixate în citometria în flux?
R: Supra-fixarea poate provoca o reticulare excesivă, ceea ce duce la autofluorescență și o legare slabă a anticorpilor, ceea ce poate afecta rezultatele citometriei în flux.
