вступ
Ви коли-небудь замислювалися, як проточна цитометрія забезпечує такий точний і надійний аналіз клітин? Ключ до точних результатів полягає в правильній фіксації клітин. Проточна цитометрія дозволяє дослідникам вивчати різні характеристики клітин, від розміру до інтенсивності флуоресценції. Однак без належної фіксації дані можуть не відображати справжні клітинні властивості. У цій статті ми дослідимо важливість фіксації клітин у проточній цитометрії, обговоримо різні методи фіксації та поділимося порадами для отримання оптимальних результатів.
Що таке фіксація клітин у проточній цитометрії?
Визначення клітинної фіксації
Фіксація клітин - це процес, який стабілізує та зберігає клітини шляхом запобігання змінам їх структури, функції та молекулярного складу. Цей процес досягається шляхом хімічного зшивання білків, ліпідів та інших клітинних компонентів, фактично «заморожуючи» клітини в їх поточному стані. Це особливо важливо для проточної цитометрії, оскільки запобігає деградації клітинних маркерів або зміні клітинних структур під час аналізу. Фіксуючи клітини, дослідники можуть переконатися, що характеристики клітин залишаються послідовними, що дозволяє проводити точні вимірювання та надійні дані під час аналізу проточної цитометрії.
Чому фіксація важлива
Правильна фіксація є важливою, оскільки вона підтримує цілісність клітинних білків і нуклеїнових кислот, які є вирішальними для точного аналізу проточної цитометрії. Якщо клітини не фіксовані, їх структура та молекулярні маркери можуть деградувати або змінюватися з часом, що призведе до ненадійних і неточних результатів. Фіксація також відіграє вирішальну роль у стабілізації клітин для багатопараметричного аналізу, що є однією з ключових переваг проточної цитометрії. Це дозволяє дослідникам одночасно оцінювати численні властивості клітин, такі як поверхневі маркери, внутрішньоклітинні білки та вміст ДНК, в одному експерименті. Без належної фіксації отримані дані можуть бути непослідовними або неповними, що призведе до неправильної інтерпретації результатів експерименту.
Типи методів фіксації для проточної цитометрії
Фіксація параформальдегідом (PFA).
Параформальдегід (PFA) є одним із найбільш широко використовуваних фіксаторів у проточній цитометрії, насамперед завдяки його ефективності у збереженні морфології та антигенності клітин. Він працює шляхом перехресного зшивання білків у клітинах, гарантуючи, що як клітинна структура, так і поверхневі білки залишаються недоторканими. Це робить PFA чудовим вибором для збереження маркерів клітинної поверхні, особливо при аналізі експресії поверхневого білка в експериментах імунофенотипування.
Рекомендація:
● Концентрація: для оптимальної фіксації зазвичай використовується 2-4% PFA.
● Час фіксації: клітини слід інкубувати в PFA протягом 15-30 хвилин при 2-8°C.
● Зберігання: після фіксації клітини слід зберігати при температурі 2-8°C для короткочасного зберігання. Важливо не зберігати фіксовані клітини протягом тривалого часу, оскільки це може призвести до втрати цілісності маркера.
Важливо уникати надмірної фіксації, оскільки тривалий вплив PFA може призвести до аутофлуоресценції клітин і завадити подальшому фарбуванню та аналізу. Завжди використовуйте мінімально необхідний час для фіксації.
Фіксація етанолом
Фіксація етанолом зазвичай використовується, коли фокус аналізу зосереджений на вмісті ДНК, наприклад, у дослідженнях клітинного циклу. Етанол є дегідратуючим агентом, який проникає через клітинну мембрану та зберігає ДНК у клітинах. Це робить фіксацію етанолом особливо корисною для аналізів на основі ДНК і проточної цитометрії, де досліджуються стадії клітинного циклу або вміст ДНК.
Рекомендація:
● Концентрація: зазвичай використовується 70-100% етанол.
● Час фіксації: фіксація етанолом зазвичай вимагає 10-15 хвилин для отримання оптимальних результатів.
Фіксація етанолом ідеально підходить для збереження фаз клітинного циклу, і її можна використовувати в поєднанні з ДНК-зв’язуючими барвниками, такими як йодид пропідію (PI), для аналізу клітинного циклу.
Фіксація метанолом
Метанол є ще одним широко використовуваним фіксатором, особливо для внутрішньоклітинних аналізів. Він діє шляхом проникнення через клітинну мембрану та стабілізації внутрішніх структур клітини. Хоча метанол ефективний у збереженні клітинних білків і антигенів, він може спричинити зморщування клітин, що може вплинути на інтерпретацію певних характеристик, таких як розмір і морфологія клітини.
Рекомендація:
● Концентрація: зазвичай використовується 90-100% метанол.
● Час фіксації: зазвичай достатньо 10-15 хвилин.
Фіксація метанолом часто використовується при вивченні внутрішньоклітинних білків, особливо при дослідженні маркерів всередині цитоплазми або ядра. Однак дослідники повинні враховувати можливість зморщування клітин при використанні фіксації метанолом.
Інші фіксатори (наприклад, формалін)
Формалін, розчин формальдегіду у воді, є іншим фіксатором, який використовується в проточній цитометрії, хоча він менш поширений, ніж PFA. Формалін широко використовується в гістології та імуногістохімії, де він ефективно зберігає зразки тканин для мікроскопічного аналізу. Хоча формалін може зберегти клітинні структури, він зазвичай не рекомендований для проточної цитометрії, якщо не працювати з фіксованими зразками тканини, оскільки він може заважати сортуванню клітин і деяким застосуванням флуоресценції. Формалінова фіксація найкраще підходить для зразків тканин, а не для окремих клітин.
Закріплювач |
Концентрація |
Час фіксації |
Рекомендоване використання |
Параформальдегід (PFA) |
2-4% |
15-30 хвилин |
Ідеально підходить для збереження маркерів клітинної поверхні; загальні для імунофенотипування |
Етанол |
70-100% |
10-15 хвилин |
Найкраще підходить для аналізу вмісту ДНК і дослідження клітинного циклу |
Метанол |
90-100% |
10-15 хвилин |
Підходить для аналізу внутрішньоклітинного білка; може спричинити зморщування клітин |
Формалін |
10% (формальдегід) |
Змінюється (залежить від тканини) |
Зазвичай використовується для фіксованих зразків тканин, а не для окремих клітин |
Покроковий посібник із фіксації клітин для проточної цитометрії
Підготовка зразка клітин
Перед фіксацією важливо виділити клітини із зразка тканини або крові. Центрифугування є найпоширенішим методом концентрування клітин у суспензії. Також важливо ретельно промити клітини, щоб видалити будь-яке культуральне середовище або залишкові забруднення, які можуть заважати процесу фіксації.
1. Виділення клітин: використовуйте стандартні методи виділення, такі як центрифугування або сортування клітин, щоб відокремити цікаві клітини.
2. Промивання: промийте клітини фосфатним буферним розчином (PBS), щоб видалити залишки середовища та забруднювачі, які можуть вплинути на процес фіксації.
Порядок фіксації
Після того, як клітини підготовлені, наступним кроком є додавання фіксатора до клітинної суспензії. Найбільш часто використовуваним фіксатором для проточної цитометрії є 2-4% розчин PFA.
1. Додайте фіксатор до клітинної суспензії, переконавшись, що вона добре перемішана.
2. Інкубуйте клітини з фіксатором протягом 15-30 хвилин при 2-8°C.
3. Після інкубації двічі промийте клітини PBS, щоб видалити надлишок фіксатора.
Етапи після фіксації
Після фіксації клітини необхідно акуратно поводити. Якщо потрібен додатковий аналіз, клітини слід пофарбувати перед аналізом. Якщо ви плануєте зберігати клітини для подальшого аналізу, ресуспендуйте їх у відповідному буфері та зберігайте при 2-8°C. Уникайте залишати клітини у фіксаторі на тривалий час, оскільки надмірна фіксація може призвести до посилення автофлуоресценції та зниження якості сигналу.
Поради щодо оптимальної фіксації при проточній цитометрії
Уникнення надмірної фіксації
Надмірна фіксація виникає, коли клітини піддаються дії фіксатора занадто довго, що може призвести до надмірного перехресного зшивання клітинних білків і погіршити якість даних. Це може призвести до аутофлуоресценції, зниження зв’язування антитіл і неточних вимірювань проточної цитометрії. Завжди перевіряйте рекомендований час фіксації для вашого конкретного типу клітин і експериментуйте, щоб уникнути надмірної фіксації.
Час фіксації проти типу зразка
Оптимальний час фіксації може змінюватися залежно від типу клітини та характеру експерименту. Наприклад, для імунних клітин може знадобитися менший час фіксації, ніж для зразків тканин. Налаштуйте час фіксації на основі конкретних потреб типу зразка. Для аналізу поверхневого білка зазвичай достатньо коротшого часу фіксації (10-15 хвилин). Для внутрішньоклітинного фарбування або аналізу ДНК може знадобитися довший час фіксації.
Фарбування після фіксації
Після фіксації клітин фарбування антитілами або флуоресцентними барвниками є критичним етапом аналізу проточної цитометрії. Деякі флуоресцентні барвники, зокрема тандемні барвники, можуть бути чутливими до фіксації та можуть погіршитися, якщо клітини надмірно фіксуються. Для отримання оптимальних результатів фарбування рекомендується фарбувати клітини перед фіксацією, коли це можливо. Це може допомогти запобігти деградації барвника та забезпечити сильніші сигнали флуоресценції.
Зберігання фіксованих клітин для проточної цитометрії
Короткочасне зберігання
Для короткочасного зберігання фіксовані клітини можна зберігати в холодильнику при 2-8°С. Це ідеально, якщо ви плануєте проаналізувати клітини протягом одного-двох днів після фіксації. Завжди зберігайте фіксовані клітини в темряві, щоб запобігти фотовідбілюванню, яке може вплинути на флуоресцентні сигнали.
Довгострокове зберігання
Для тривалого зберігання клітини можна заморозити в середовищах для кріоконсервації. Типове середовище для кріоконсервації складається з 10% диметилсульфоксиду (ДМСО) і 90% фетальної бичачої сироватки (FBS). Проте розчини для кріоконсервації без сироватки, такі як mFreSR™ або CryoStor™ CS10, також доступні, і їх можна використовувати, щоб уникнути проблем, пов’язаних із FBS. Щоб запобігти утворенню кристалів льоду, використовуйте морозильну камеру з контрольованою швидкістю для заморожування клітин. Це допомагає підтримувати життєздатність клітин і забезпечує належне зберігання.
Поширені підводні камені, яких слід уникати під час фіксації клітин для проточної цитометрії
Наслідки неправильної фіксації
Неправильна фіксація може призвести до кількох проблем, у тому числі до аутофлуоресценції, зниження зв’язування антитіл і поганої життєздатності клітин. Ці проблеми можуть значно вплинути на точність і надійність результатів проточної цитометрії. Завжди перевіряйте протоколи фіксації для конкретного типу зразка та переконайтеся, що умови фіксації відповідають типу клітин і маркерів, які аналізуються.
Вибір правильного фіксатора для вашого застосування
Вибір відповідного фіксатора для експерименту з проточною цитометрією має вирішальне значення для отримання надійних і точних результатів. Різні фіксатори краще підходять для різних застосувань. Наприклад, PFA зазвичай використовується для аналізу поверхневих білків, тоді як етанол ідеально підходить для досліджень на основі ДНК. Перед початком експерименту дослідіть найкращий фіксатор для вашого конкретного застосування та відповідно відкоригуйте протокол фіксації.
Висновок
Правильна фіксація клітин має важливе значення для досягнення успішного аналізу проточної цитометрії. Він допомагає зберегти клітинні структури та забезпечує цілісність білків і ДНК. Дотримуючись належних протоколів фіксації та уникаючи надмірної фіксації, дослідники можуть підвищити точність і надійність даних. Вибір відповідного фіксатора для вашого експерименту покращує загальну якість ваших результатів. Застосування цих найкращих практик гарантує, що ваш аналіз проточної цитометрії забезпечить послідовне, відтворюване розуміння клітинних функцій.
Правильна фіксація клітин відіграє ключову роль у проточній цитометрії та продуктах з HKeybio пропонує надійні рішення. Їх пропозиції забезпечують отримання високоякісних результатів і їм довіряють дослідники з усього світу щодо точного аналізу клітин.
FAQ
З: Яка важливість фіксації клітин у проточній цитометрії?
Відповідь: Фіксація клітин має вирішальне значення в проточній цитометрії, оскільки вона зберігає клітинні структури та забезпечує цілісність білків і ДНК для точного аналізу.
П: Як довго потрібно фіксувати клітини для проточної цитометрії?
Відповідь: зазвичай клітини слід фіксувати протягом 15-30 хвилин 2-4% розчином параформальдегіду (PFA), щоб зберегти цілісність клітин.
З: Чи можна використовувати етанол для фіксації клітин у проточній цитометрії?
A: Так, фіксація етанолом зазвичай використовується для аналізу вмісту ДНК у проточній цитометрії, особливо для досліджень клітинного циклу.
З: Що станеться, якщо клітини надмірно фіксуються в проточній цитометрії?
A: Надмірна фіксація може спричинити надмірне перехресне зшивання, що призводить до автофлуоресценції та поганого зв’язування антитіл, що може вплинути на результати проточної цитометрії.
