どのようにして考えたことがありますか フローサイトメトリーは、 このような正確で信頼性の高い細胞分析を実現しますか?正確な結果の鍵は、適切な細胞固定にあります。フローサイトメトリーを使用すると、サイズから蛍光強度に至るまで、さまざまな細胞特性を研究できます。ただし、適切に固定しないと、データは真の細胞特性を反映しない可能性があります。この記事では、フローサイトメトリーにおける細胞固定の重要性を探り、さまざまな固定方法について説明し、最適な結果のためのヒントを共有します。
細胞固定は、細胞の構造、機能、分子組成の変化を防ぐことで細胞を安定化および保存するプロセスです。このプロセスは、タンパク質、脂質、その他の細胞成分を化学的に架橋し、細胞を現在の状態で効果的に「凍結」することによって実現されます。これは、分析中の細胞マーカーの分解や細胞構造の変化を防ぐため、フローサイトメトリーでは特に重要です。細胞を固定することで、研究者は細胞の特性が一貫したままであることを保証できるため、フローサイトメトリー分析中に正確な測定と信頼性の高いデータが可能になります。
適切な固定は、正確なフローサイトメトリー分析に不可欠な細胞タンパク質と核酸の完全性を維持するため、不可欠です。細胞が固定されていない場合、その構造や分子マーカーが時間の経過とともに劣化または変化し、信頼性が低く不正確な結果が得られる可能性があります。固定は、フローサイトメトリーの重要な強みの 1 つである、マルチパラメーター分析のために細胞を安定化する上でも重要な役割を果たします。これにより、研究者は、表面マーカー、細胞内タンパク質、DNA 含有量などの複数の細胞の特徴を 1 回の実験で同時に評価できます。適切に固定しないと、得られるデータが一貫性がなかったり不完全になったりして、実験結果の誤解につながる可能性があります。
パラホルムアルデヒド (PFA) は、主に細胞の形態と抗原性を保存する効果があるため、フローサイトメトリーで最も広く使用されている固定液の 1 つです。これは細胞内のタンパク質を架橋することによって機能し、細胞構造と表面タンパク質の両方が無傷のままであることを保証します。このため、PFA は、特に免疫表現型実験で表面タンパク質の発現を分析する場合に、細胞表面マーカーを保存するための優れた選択肢となります。
おすすめ：
● 濃度: 最適な固定には 2 ～ 4% PFA が一般的に使用されます。
● 固定時間: 細胞は PFA 中で 2 ～ 8°C で 15 ～ 30 分間インキュベートする必要があります。
● 保管: 固定後の細胞は、短期保管の場合は 2 ～ 8°C で保管してください。マーカーの完全性が失われる可能性があるため、固定細胞を長期間保存しないことが重要です。
PFA に長時間さらされると細胞の自己蛍光が発生し、その後の染色や分析が妨げられる可能性があるため、過剰な固定を避けることが重要です。固定には常に必要最小限の時間を費やしてください。
エタノール固定は、細胞周期研究など、分析の焦点が DNA 内容にある場合に一般的に使用されます。エタノールは細胞膜に浸透し、細胞内の DNA を保存することによって機能する脱水剤です。このため、エタノール固定は、細胞周期段階や DNA 含有量を検査する DNA ベースのアッセイやフローサイトメトリー分析に特に役立ちます。
おすすめ：
● 濃度: 通常、70 ～ 100% のエタノールが使用されます。
● 固定時間: エタノール固定では、最適な結果が得られるまでに通常 10 ～ 15 分かかります。
エタノール固定は細胞周期相の保存に理想的であり、細胞周期解析にはヨウ化プロピジウム (PI) などの DNA 結合色素と組み合わせて使用できます。
メタノールも、特に細胞内分析に一般的に使用される固定剤です。細胞膜を貫通し、細胞の内部構造を安定化させることによって作用します。メタノールは細胞タンパク質や抗原の保存には効果的ですが、細胞の収縮を引き起こす可能性があり、細胞のサイズや形態などの特定の特徴の解釈に影響を与える可能性があります。
おすすめ：
● 濃度: 通常、90 ～ 100% のメタノールが使用されます。
● 固定時間: 通常は 10 ～ 15 分で十分です。
メタノール固定は、細胞内タンパク質を研究する場合、特に細胞質または核内のマーカーを調べる場合によく使用されます。ただし、メタノール固定を使用する場合、研究者は細胞が収縮する可能性を考慮する必要があります。
ホルムアルデヒドの水溶液であるホルマリンもフローサイトメトリーで使用される固定剤の 1 つですが、PFA ほど一般的ではありません。ホルマリンは組織学や免疫組織化学で広く使用されており、顕微鏡分析用に組織サンプルを効果的に保存します。ホルマリンは細胞構造を保存できますが、細胞選別や一部の蛍光アプリケーションを妨げる可能性があるため、固定組織サンプルを使用する場合を除き、フローサイトメトリーには一般的に推奨されません。ホルマリン固定は、個々の細胞ではなく、組織サンプルに最適です。
固定剤 |
集中 |
固定時間 |
推奨される使用方法 |
パラホルムアルデヒド (PFA) |
2～4% |
15～30分 |
細胞表面マーカーの保存に最適です。免疫表現型検査に一般的 |
エタノール |
70-100% |
10～15分 |
DNA 内容分析と細胞周期研究に最適 |
メタノール |
90-100% |
10～15分 |
細胞内タンパク質の分析に適しています。細胞の収縮を引き起こす可能性があります |
ホルマリン |
10%(ホルムアルデヒド) |
異なります（組織によって異なります） |
通常、個々の細胞ではなく、固定組織サンプルに使用されます。 |
固定前に、組織または血液サンプルから細胞を分離することが不可欠です。遠心分離は、懸濁液中の細胞を濃縮するために使用される最も一般的な方法です。細胞を徹底的に洗浄して、固定プロセスを妨げる可能性のある培地や残留汚染物質を除去することも重要です。
1. 細胞の分離: 遠心分離やセルソーティングなどの標準的な分離方法を使用して、目的の細胞を分離します。
2. 洗浄: 細胞をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で洗浄して、固定プロセスに影響を与える可能性のある残留培地や汚染物質を除去します。
細胞が準備されたら、次のステップは細胞懸濁液に固定剤を添加することです。フローサイトメトリーに最も一般的に使用される固定液は、2 ～ 4% PFA 溶液です。
1. 固定剤を細胞懸濁液に加え、よく混合されていることを確認します。
2. 細胞を固定液とともに 2 ～ 8°C で 15 ～ 30 分間インキュベートします。
3. インキュベーション後、細胞を PBS で 2 回洗浄し、過剰な固定液を除去します。
固定後の細胞は慎重に取り扱う必要があります。さらなる分析が必要な場合は、分析前に細胞を染色する必要があります。将来の分析のために細胞を保存する予定がある場合は、細胞を適切なバッファーに再懸濁し、2 ～ 8°C で保存します。過剰な固定は自己蛍光の増加やシグナル品質の低下につながる可能性があるため、細胞を固定液中に長時間放置しないでください。
過剰固定は、細胞が固定液に長時間さらされると発生し、細胞タンパク質の過剰な架橋が生じ、データの品質が損なわれる可能性があります。これにより、自己蛍光、抗体結合の減少、および不正確なフローサイトメトリー測定が発生する可能性があります。特定の細胞タイプに推奨される固定時間を常に確認し、過剰固定を避けるために実験してください。
最適な固定時間は、細胞の種類や実験の性質によって異なる場合があります。たとえば、免疫細胞は組織サンプルよりも短い固定時間を必要とする場合があります。サンプルの種類の特定のニーズに基づいて固定時間を調整します。表面タンパク質分析の場合、通常は短い固定時間 (10 ～ 15 分) で十分です。細胞内染色または DNA 分析の場合は、より長い固定時間が必要になる場合があります。
細胞を固定した後、抗体または蛍光色素で染色することは、フローサイトメトリー分析における重要なステップです。一部の蛍光色素、特にタンデム色素は固定に敏感で、細胞が過剰に固定されると劣化する可能性があります。最適な染色結果を得るには、可能な限り固定前に細胞を染色することをお勧めします。これは色素の劣化を防ぎ、より強い蛍光シグナルを確保するのに役立ちます。
短期保存の場合、固定細胞は 2 ～ 8°C の冷蔵庫で保存できます。これは、固定後 1 ～ 2 日以内に細胞を分析する予定がある場合に最適です。蛍光シグナルに影響を与える可能性がある光退色を防ぐため、固定細胞は常に暗所で保管してください。
長期保存の場合、細胞を凍結保存培地で凍結することができます。一般的な凍結保存培地は、10% ジメチルスルホキシド (DMSO) と 90% ウシ胎児血清 (FBS) で構成されます。ただし、mFreSR™ や CryoStor™ CS10 などの無血清凍結保存ソリューションも利用でき、FBS に関連する問題を回避するために使用できます。氷結晶の形成を防ぐには、速度制御された冷凍庫を使用して細胞を凍結します。これにより、細胞の生存率が維持され、適切な保管が保証されます。
不適切な固定は、自己蛍光、抗体結合の減少、細胞生存率の低下など、いくつかの問題を引き起こす可能性があります。これらの問題は、フローサイトメトリー結果の精度と信頼性に大きな影響を与える可能性があります。特定のサンプルタイプの固定プロトコルを常に確認し、固定条件が分析対象の細胞タイプとマーカーに適切であることを確認してください。
フローサイトメトリー実験に適切な固定液を選択することは、信頼性が高く正確な結果を得るために非常に重要です。異なる固定剤は異なる用途に適しています。たとえば、PFA は表面タンパク質分析に一般的に使用されますが、エタノールは DNA ベースの研究に最適です。実験を開始する前に、特定の用途に最適な固定剤を調べ、それに応じて固定プロトコルを調整します。
フローサイトメトリー分析を成功させるには、適切な細胞固定が不可欠です。細胞構造の保存に役立ち、タンパク質と DNA の完全性を保証します。適切な固定プロトコルに従い、過剰な固定を回避することで、研究者はデータの精度と信頼性を高めることができます。実験に適切な固定剤を選択すると、結果の全体的な品質が向上します。これらのベスト プラクティスを実装すると、フロー サイトメトリー分析により細胞機能について一貫した再現可能な洞察が得られます。
適切な細胞固定はフローサイトメトリーとその製品において重要な役割を果たします。 HKeybio は 信頼性の高いソリューションを提供します。同社の製品は高品質の結果を保証し、正確な細胞分析に関して世界中の研究者から信頼されています。
A: 細胞固定は、正確な分析のために細胞構造を保存し、タンパク質と DNA の完全性を保証するため、フローサイトメトリーにおいて非常に重要です。
A: 細胞の完全性を維持するには、通常、細胞を 2 ～ 4% パラホルムアルデヒド (PFA) 溶液で 15 ～ 30 分間固定する必要があります。
A: はい、エタノール固定は、フローサイトメトリーにおける DNA 含有量分析、特に細胞周期研究に一般的に使用されます。
A: 過剰な固定は過剰な架橋を引き起こし、自己蛍光や抗体結合の低下につながり、フローサイトメトリーの結果に影響を与える可能性があります。
