Introdução
Você já se perguntou como a citometria de fluxo consegue uma análise celular tão precisa e confiável? A chave para resultados precisos reside na fixação adequada das células. A citometria de fluxo permite aos pesquisadores estudar uma variedade de características celulares, desde o tamanho até a intensidade da fluorescência. No entanto, sem a fixação adequada, os dados podem não refletir as verdadeiras propriedades celulares. Neste artigo, exploraremos a importância da fixação celular na citometria de fluxo, discutiremos diferentes métodos de fixação e compartilharemos dicas para obter melhores resultados.
O que é fixação celular em citometria de fluxo?
Definição de fixação celular
A fixação celular é um processo que estabiliza e preserva as células, evitando alterações em sua estrutura, função e composição molecular. Este processo é conseguido através da ligação química cruzada de proteínas, lipídios e outros componentes celulares, “congelando” efetivamente as células em seu estado atual. Isto é particularmente importante na citometria de fluxo porque evita a degradação de marcadores celulares ou a alteração de estruturas celulares durante a análise. Ao fixar as células, os pesquisadores podem garantir que as características das células permaneçam consistentes, o que permite medições precisas e dados confiáveis durante a análise de citometria de fluxo.
Por que a fixação é importante
A fixação adequada é essencial porque mantém a integridade das proteínas celulares e dos ácidos nucleicos, que são cruciais para uma análise precisa da citometria de fluxo. Se as células não forem fixas, a sua estrutura e marcadores moleculares podem degradar-se ou alterar-se ao longo do tempo, levando a resultados pouco fiáveis e imprecisos. A fixação também desempenha um papel crítico na estabilização das células para análise multiparâmetro, que é um dos principais pontos fortes da citometria de fluxo. Ele permite que os pesquisadores avaliem simultaneamente múltiplas características celulares, como marcadores de superfície, proteínas intracelulares e conteúdo de DNA, em um único experimento. Sem a fixação adequada, os dados obtidos podem ser inconsistentes ou incompletos, levando a interpretações erradas dos resultados experimentais.
Tipos de métodos de fixação para citometria de fluxo
Fixação de Paraformaldeído (PFA)
O paraformaldeído (PFA) é um dos fixadores mais utilizados na citometria de fluxo, principalmente devido à sua eficácia na preservação da morfologia e antigenicidade celular. Funciona através da ligação cruzada de proteínas dentro das células, garantindo que tanto a estrutura celular como as proteínas de superfície permaneçam intactas. Isso torna o PFA uma excelente escolha para preservar marcadores de superfície celular, especialmente ao analisar a expressão de proteínas de superfície em experimentos de imunofenotipagem.
Recomendação:
● Concentração: 2-4% de PFA é comumente usado para fixação ideal.
● Tempo de fixação: As células devem ser incubadas em PFA durante 15-30 minutos a 2-8°C.
● Armazenamento: Após a fixação, as células devem ser armazenadas entre 2 e 8°C para armazenamento de curto prazo. É importante não armazenar células fixas por longos períodos, pois isso pode levar à perda da integridade do marcador.
É importante evitar a fixação excessiva, pois a exposição prolongada ao PFA pode levar à autofluorescência celular e interferir na coloração e análise subsequentes. Sempre use o tempo mínimo necessário para fixação.
Fixação de etanol
A fixação de etanol é comumente usada quando o foco da análise está no conteúdo de DNA, como em estudos do ciclo celular. O etanol é um agente desidratante que atua penetrando na membrana celular e preservando o DNA dentro das células. Isto torna a fixação de etanol particularmente útil para ensaios baseados em DNA e análises de citometria de fluxo onde os estágios do ciclo celular ou o conteúdo de DNA estão sendo examinados.
Recomendação:
● Concentração: Normalmente utiliza-se 70-100% de etanol.
● Tempo de fixação: A fixação do etanol normalmente requer de 10 a 15 minutos para obter resultados ideais.
A fixação de etanol é ideal para preservar as fases do ciclo celular e pode ser usada em combinação com corantes de ligação ao DNA, como o iodeto de propídio (PI) para análise do ciclo celular.
Fixação de metanol
O metanol é outro fixador comumente utilizado, especialmente para análises intracelulares. Atua penetrando na membrana celular e estabilizando as estruturas internas da célula. Embora o metanol seja eficaz na preservação de proteínas e antígenos celulares, ele pode causar encolhimento celular, o que pode impactar a interpretação de certas características, como tamanho e morfologia celular.
Recomendação:
● Concentração: Normalmente utiliza-se 90-100% de metanol.
● Tempo de fixação: 10-15 minutos geralmente são suficientes.
A fixação de metanol é frequentemente empregada no estudo de proteínas intracelulares, especialmente ao examinar marcadores dentro do citoplasma ou do núcleo. No entanto, os investigadores devem considerar o potencial de encolhimento celular ao utilizar a fixação de metanol.
Outros fixadores (por exemplo, formalina)
A formalina, uma solução de formaldeído em água, é outro fixador utilizado na citometria de fluxo, embora seja menos comum que o PFA. A formalina é amplamente utilizada em histologia e imuno-histoquímica, onde preserva efetivamente amostras de tecido para análise microscópica. Embora a formalina possa preservar estruturas celulares, geralmente não é recomendada para citometria de fluxo, a menos que se trabalhe com amostras de tecido fixas, pois pode interferir na classificação celular e em algumas aplicações de fluorescência. A fixação com formalina é mais adequada para amostras de tecido, não para células individuais.
Fixador |
Concentração |
Tempo de fixação |
Uso recomendado |
Paraformaldeído (PFA) |
2-4% |
15-30 minutos |
Ideal para preservar marcadores de superfície celular; comum para imunofenotipagem |
Etanol |
70-100% |
10-15 minutos |
Melhor para análise de conteúdo de DNA e estudos de ciclo celular |
Metanol |
90-100% |
10-15 minutos |
Adequado para análise de proteínas intracelulares; pode causar encolhimento celular |
Formalina |
10% (formaldeído) |
Varia (depende do tecido) |
Geralmente usado para amostras de tecido fixas, não para células individuais |
Guia passo a passo para fixação de células para citometria de fluxo
Preparando a amostra celular
Antes da fixação, é essencial isolar as células do tecido ou da amostra de sangue. A centrifugação é o método mais comum usado para concentrar células em suspensão. Também é fundamental lavar bem as células para remover quaisquer meios de cultura ou contaminantes residuais, que possam interferir no processo de fixação.
1. Isolamento celular: Use métodos de isolamento padrão, como centrifugação ou classificação de células para separar as células de interesse.
2. Lavagem: Lave as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover meios residuais e contaminantes que possam afetar o processo de fixação.
Procedimento de fixação
Uma vez preparadas as células, o próximo passo é adicionar o fixador à suspensão celular. O fixador mais comumente usado para citometria de fluxo é uma solução de PFA a 2-4%.
1. Adicione o fixador à suspensão de células, garantindo que esteja bem misturado.
2. Incubar as células com o fixador durante 15-30 minutos a 2-8°C.
3. Após a incubação, lave as células duas vezes com PBS para remover o excesso de fixador.
Etapas pós-fixação
Após a fixação, as células devem ser manuseadas com cuidado. Se for necessária uma análise mais aprofundada, as células devem ser coradas antes da análise. Se você planeja armazenar as células para análise futura, ressuspenda-as em um tampão apropriado e armazene-as entre 2 e 8°C. Evite deixar células no fixador por longos períodos, pois a fixação excessiva pode levar ao aumento da autofluorescência e à redução da qualidade do sinal.
Dicas para fixação ideal em citometria de fluxo
Evitando fixação excessiva
A fixação excessiva ocorre quando as células são expostas ao fixador por muito tempo, o que pode resultar em reticulação excessiva de proteínas celulares e comprometer a qualidade dos dados. Isto pode levar à autofluorescência, redução da ligação de anticorpos e medições imprecisas de citometria de fluxo. Verifique sempre os tempos de fixação recomendados para o seu tipo de célula específico e experimente para evitar fixação excessiva.
Tempo de fixação vs. tipo de amostra
O tempo de fixação ideal pode variar dependendo do tipo de célula e da natureza do experimento. Por exemplo, as células do sistema imunológico podem exigir tempos de fixação mais curtos do que as amostras de tecido. Ajuste o tempo de fixação com base nas necessidades específicas do tipo de amostra. Para análise de proteínas de superfície, um tempo de fixação mais curto (10-15 minutos) é geralmente suficiente. Para coloração intracelular ou análise de DNA, pode ser necessário um tempo de fixação mais longo.
Coloração Após Fixação
Depois de fixar as células, a coloração com anticorpos ou corantes fluorescentes é um passo crítico na análise de citometria de fluxo. Alguns corantes fluorescentes, particularmente os corantes tandem, podem ser sensíveis à fixação e podem degradar-se se as células forem fixadas em excesso. Para obter resultados de coloração óptimos, recomenda-se corar as células antes da fixação, sempre que possível. Isto pode ajudar a prevenir a degradação do corante e garantir sinais de fluorescência mais fortes.
Armazenamento de células fixas para citometria de fluxo
Armazenamento de curto prazo
Para armazenamento de curto prazo, as células fixas podem ser armazenadas na geladeira entre 2-8°C. Isto é ideal quando você planeja analisar as células um ou dois dias após a fixação. Guarde sempre as células fixas no escuro para evitar a fotodegradação, que pode afetar os sinais fluorescentes.
Armazenamento de longo prazo
Para armazenamento a longo prazo, as células podem ser congeladas em meios de criopreservação. Um meio típico de criopreservação consiste em 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) e 90% de soro fetal bovino (FBS). No entanto, soluções de criopreservação sem soro, como mFreSR™ ou CryoStor™ CS10, também estão disponíveis e podem ser usadas para evitar problemas associados ao FBS. Para evitar a formação de cristais de gelo, use um freezer com taxa controlada para congelar as células. Isso ajuda a manter a viabilidade celular e garante o armazenamento adequado.
Armadilhas comuns a serem evitadas na fixação celular para citometria de fluxo
Efeitos da fixação inadequada
A fixação inadequada pode levar a vários problemas, incluindo autofluorescência, redução da ligação de anticorpos e baixa viabilidade celular. Estas questões podem afetar significativamente a precisão e a confiabilidade dos resultados da citometria de fluxo. Verifique sempre os protocolos de fixação para o seu tipo de amostra específico e certifique-se de que as condições de fixação são apropriadas para o tipo de célula e marcadores que estão sendo analisados.
Escolhendo o fixador certo para sua aplicação
Escolher o fixador apropriado para o seu experimento de citometria de fluxo é crucial para obter resultados confiáveis e precisos. Diferentes fixadores são mais adequados para diferentes aplicações. Por exemplo, o PFA é comumente usado para análise de proteínas de superfície, enquanto o etanol é ideal para estudos baseados em DNA. Antes de iniciar o experimento, pesquise o melhor fixador para sua aplicação específica e ajuste o protocolo de fixação adequadamente.
Conclusão
A fixação celular adequada é essencial para obter uma análise de citometria de fluxo bem-sucedida. Ajuda a preservar as estruturas celulares e garante a integridade das proteínas e do DNA. Seguindo protocolos de fixação adequados e evitando a fixação excessiva, os pesquisadores podem aumentar a precisão e a confiabilidade dos dados. A seleção do fixador apropriado para o seu experimento melhora a qualidade geral dos seus resultados. A implementação dessas práticas recomendadas garante que sua análise de citometria de fluxo forneça insights consistentes e reprodutíveis sobre as funções celulares.
A fixação celular adequada desempenha um papel fundamental na citometria de fluxo, e os produtos de HKeybio oferece soluções confiáveis. Suas ofertas garantem resultados de alta qualidade e contam com a confiança de pesquisadores em todo o mundo para análises celulares precisas.
Perguntas frequentes
P: Qual é a importância da fixação celular na citometria de fluxo?
R: A fixação celular é crucial na citometria de fluxo, pois preserva as estruturas celulares e garante a integridade das proteínas e do DNA para uma análise precisa.
P: Por quanto tempo as células devem ser fixadas para citometria de fluxo?
R: As células normalmente devem ser fixadas por 15 a 30 minutos com uma solução de paraformaldeído (PFA) de 2 a 4% para manter a integridade celular.
P: Posso usar etanol para fixação celular em citometria de fluxo?
R: Sim, a fixação de etanol é comumente usada para análise de conteúdo de DNA em citometria de fluxo, especialmente para estudos do ciclo celular.
P: O que acontece se as células estiverem excessivamente fixadas na citometria de fluxo?
R: A fixação excessiva pode causar reticulação excessiva, levando à autofluorescência e à má ligação dos anticorpos, o que pode afetar os resultados da citometria de fluxo.
