Réamhrá
Ar smaoinigh tú riamh conas shreabh-chíteiméadracht ? baintear amach anailís cille beacht agus iontaofa mar Is é fosúchán ceart cille an eochair do thorthaí cruinne. Ligeann citeiméadracht sreafa do thaighdeoirí staidéar a dhéanamh ar shaintréithe éagsúla cealla, ó mhéid go déine fluaraiseachta. Mar sin féin, gan socrú cuí, b'fhéidir nach léireodh na sonraí fíor-airíonna ceallacha. San Airteagal seo, déanfaimid iniúchadh ar an tábhacht a bhaineann le fosúchán cille i gcíteiméadracht sreafa, pléifimid modhanna éagsúla socraithe, agus roinnfimid leideanna le haghaidh na dtorthaí is fearr.
Cad é Fosúchán Cille i gCítiméadracht Sreafa?
Sainmhíniú ar Fhosúchán Cille
Is próiseas é fosúchán cille a chobhsaíonn agus a chaomhnaíonn na cealla trí athruithe ar a struchtúr, a bhfeidhm agus a gcomhdhéanamh móilíneach a chosc. Baintear an próiseas seo amach trí phróitéiní, lipidí agus comhpháirteanna ceallacha eile a thrasnascadh go ceimiceach, go héifeachtach “reo” na cealla ina staid reatha. Tá sé seo tábhachtach go háirithe i gcíteiméadracht sreafa toisc go seachnaíonn sé díghrádú marcóirí ceallacha nó athrú ar struchtúir cheallacha le linn na hanailíse. Trí na cealla a shocrú, is féidir le taighdeoirí a chinntiú go bhfanann tréithe na gceall comhsheasmhach, rud a cheadaíonn tomhais beachta agus sonraí iontaofa le linn anailíse citoiméadrachta sreafa.
Cén Fáth a bhfuil Fosúchán Tábhachtach
Tá socrú cuí riachtanach toisc go gcoimeádann sé sláine na bpróitéiní ceallacha agus na n-aigéad núicléach, atá ríthábhachtach le haghaidh anailís chruinn cíteiméadrachta sreafa. Mura bhfuil cealla seasta, féadfaidh a struchtúr agus a marcóirí móilíneacha díghrádú nó athrú le himeacht ama, rud a fhágann go mbeidh torthaí neamhiontaofa agus míchruinn. Tá ról ríthábhachtach ag fosúchán freisin maidir le cealla a chobhsú le haghaidh anailíse ilpharaiméadair, atá ar cheann de phríomhláidreachtaí na cíteiméadrachta sreafa. Ligeann sé do thaighdeoirí measúnú comhuaineach a dhéanamh ar ghnéithe iolracha cille, mar mharcóirí dromchla, próitéiní intracellular, agus ábhar DNA, i dturgnamh amháin. Gan socrú cuí, d’fhéadfadh na sonraí a fhaightear a bheith neamh-chomhsheasmhach nó neamhiomlán, rud a d’fhágfadh go ndéanfaí míthuiscint ar thorthaí an turgnaimh.
Cineálacha Modhanna Socraithe le haghaidh Cíteiméadracht Sreafa
Fosúchán paraformaildéad (PFA).
Tá paraformaldehyde (PFA) ar cheann de na fosaitheoirí is mó a úsáidtear i gcíteiméadracht sreafa, go príomha mar gheall ar a éifeachtacht i gcaomhnú moirfeolaíocht cille agus antigenicity. Oibríonn sé trí phróitéiní a thrasnasc laistigh de na cealla, ag cinntiú go bhfanann an struchtúr ceallach agus na próitéiní dromchla araon slán. Déanann sé seo PFA mar rogha iontach chun marcóirí dromchla cille a chaomhnú, go háirithe nuair a dhéantar anailís ar léiriú próitéine dromchla i dturgnaimh imdhíon-fhéinitíopála.
Moladh:
● Tiúchan: Úsáidtear 2-4% PFA go coitianta le haghaidh socrú optamach.
● Am Socraithe: Ba chóir cealla a ghoradh i PFA ar feadh 15-30 nóiméad ag 2-8°C.
● Stóráil: Tar éis an tsocraithe, ba chóir cealla a stóráil ag 2-8°C le haghaidh stórála gearrthéarmach. Tá sé tábhachtach gan cealla seasta a stóráil ar feadh tréimhsí fada, mar go bhféadfadh sé seo a bheith mar thoradh ar chailliúint sláine marcóra.
Tá sé tábhachtach ró-shocrú a sheachaint, mar go bhféadfadh uathfhluaraiseacht cheallacha a bheith mar thoradh ar nochtadh fada do PFA agus cur isteach ar staining agus anailís ina dhiaidh sin. Úsáid i gcónaí an t-íosmhéid ama atá ag teastáil le haghaidh socraithe.
Fosúchán Eatánóil
Úsáidtear fosúchán eatánóil go coitianta nuair a bhíonn fócas na hanailíse ar ábhar DNA, mar shampla i staidéir ar thimthriall cille. Is oibreán díhiodráitithe é eatánól a oibríonn trí dhul isteach sa chillscannán agus an DNA a chaomhnú laistigh de na cealla. Déanann sé seo fosúchán eatánóil thar a bheith úsáideach do thástálacha DNA-bhunaithe agus d’anailísí citoiméadrachta sreafa ina bhfuil céimeanna timthriall cille nó ábhar DNA á scrúdú.
Moladh:
● Tiúchan: De ghnáth, úsáidtear eatánól 70-100%.
● Am Socrúcháin: De ghnáth bíonn 10-15 nóiméad de dhíth ar shocrú eatánóil chun na torthaí is fearr a bhaint amach.
Tá fosúchán eatánóil iontach chun céimeanna timthriall cille a chaomhnú, agus is féidir é a úsáid i gcomhar le ruaimeanna ceangailteacha DNA mar iaidíd propidium (PI) le haghaidh anailíse timthriall cille.
Fosúchán meatánóil
Is fostóir eile a úsáidtear go coitianta é meatánól, go háirithe le haghaidh anailísí intracellular. Oibríonn sé trí dhul isteach sa chillscannán agus trí struchtúir inmheánacha na cille a chobhsú. Cé go bhfuil meatánól éifeachtach chun próitéiní ceallacha agus antaiginí a chaomhnú, féadfaidh sé crapadh cille a chur faoi deara, rud a d'fhéadfadh tionchar a bheith aige ar léirmhíniú gnéithe áirithe, amhail méid cille agus moirfeolaíocht.
Moladh:
● Tiúchan: De ghnáth, úsáidtear meatánól 90-100%.
● Am Socrúcháin: De ghnáth is leor 10-15 nóiméad.
Is minic a úsáidtear fosúchán meatánóil nuair a dhéantar staidéar ar phróitéiní infhéitheacha, go háirithe agus marcóirí á scrúdú taobh istigh den chíteaplasma nó den núicléas. Mar sin féin, ba cheart do thaighdeoirí smaoineamh ar an bpoitéinseal a bhaineann le crapadh cille agus fosúchán meatánóil á úsáid acu.
Fixatives Eile (m.sh., Formalin)
Is fostóir eile é formailn, tuaslagán formaildéad in uisce, a úsáidtear i gcíteiméadracht sreafa, cé nach bhfuil sé chomh coitianta ná PFA. Úsáidtear Formalin go forleathan i histeolaíocht agus imdhíonhistochemistry, áit a gcaomhnaíonn sé go héifeachtach samplaí fíocháin le haghaidh anailíse micreascópach. Cé gur féidir le formalin struchtúir cille a chaomhnú, ní mholtar go ginearálta é le haghaidh citeiméadracht sreafa mura n-oibríonn sé le samplaí fíocháin sheasta, toisc go bhféadfadh sé cur isteach ar shórtáil cille agus ar roinnt feidhmeanna fluaraiseachta. Is fearr a oireann fosúchán formailin do shamplaí fíocháin, ní do chealla aonair.
Deisigh |
Tiúchan |
Am Fosúchán |
Úsáid Molta |
Paraformaldehyde (PFA) |
2-4% |
15-30 nóiméad |
Ideal chun marcóirí dromchla cille a chaomhnú; coitianta le haghaidh imdhíonfheinitíopáil |
Eatánól |
70-100% |
10-15 nóiméad |
Is fearr le haghaidh anailíse ábhar DNA agus staidéir timthriall cille |
meatánól |
90-100% |
10-15 nóiméad |
Oiriúnach le haghaidh anailíse próitéine intracellular; d'fhéadfadh crapadh cille a chur faoi deara |
Formailin |
10% (formaildéad) |
Athraíonn (ag brath ar fhíocháin) |
Úsáidtear go ginearálta le haghaidh samplaí fíocháin sheasta, ní le haghaidh cealla aonair |
Treoir Céim ar Chéim maidir le Cealla a Shocrú le haghaidh Cíteiméadracht Sreafa
Sampla na Cille a Ullmhú
Roimh an socrú, tá sé riachtanach na cealla a leithlisiú ón bhfíochán nó ón sampla fola. Is é lártheifneoiriú an modh is coitianta a úsáidtear chun cealla a dhíriú i bhfionraí. Tá sé ríthábhachtach freisin na cealla a ní go críochnúil chun aon mheán cultúir nó ábhar salaithe iarmharach a bhaint a d'fhéadfadh cur isteach ar an bpróiseas fosúcháin.
1. Leithlisiú Cille: Bain úsáid as modhanna caighdeánacha leithlisithe cosúil le lártheifneoiriú nó sórtáil cille chun na cealla spéise a scaradh.
2. Níochán: Nigh na cealla le saline maolánach fosfáit (PBS) chun meáin iarmharacha agus ábhar salaithe a d'fhéadfadh cur isteach ar an bpróiseas fosúcháin a bhaint.
Nós Imeachta Socrúcháin
Nuair a bheidh na cealla ullmhaithe, is é an chéad chéim eile an fostóir a chur leis an bhfionraí cille. Is é an fixative is coitianta a úsáidtear le haghaidh cíteiméadracht sreafa réiteach PFA 2-4%.
1. Cuir an fostóir leis an bhfionraí cille, ag cinntiú go bhfuil sé measctha go maith.
2. Gor na cealla leis an fostóir ar feadh 15-30 nóiméad ag 2-8°C.
3. Tar éis an goir, nigh na cealla faoi dhó le PBS chun an fostóir breise a bhaint.
Céimeanna Iar-Socraithe
Tar éis an fosúchán, ní mór na cealla a láimhseáil go cúramach. Má tá gá le tuilleadh anailíse, ba chóir cealla a dhathú roimh anailís. Má tá sé ar intinn agat na cealla a stóráil le haghaidh anailíse sa todhchaí, cuir ar fionraí iad i maolán cuí agus stóráil ag 2-8 °C iad. Seachain cealla a fhágáil sa fostóir ar feadh tréimhsí fada, mar is féidir méadú ar autofluaraiseacht agus cáilíocht comhartha laghdaithe mar thoradh ar ró-shocrú.
Leideanna maidir le Socrú is Fearr i gCítiméadracht Sreabhadh
Ró-Socrú a Sheachaint
Tarlaíonn ró-shocrú nuair a nochtar cealla don fostóir ar feadh ró-fhada, rud a d’fhéadfadh tras-nascadh iomarcach próitéiní cealla a bheith mar thoradh air agus cáilíocht na sonraí a chur i mbaol. D'fhéadfadh uathfhluaraiseacht, ceangailteach antasubstainte laghdaithe, agus tomhais cíteaiméadrachta sreafa míchruinn a bheith mar thoradh air seo. Seiceáil i gcónaí na hamanna socraithe atá molta do do chineál sonrach cille agus déan turgnamh chun ró-shocrú a sheachaint.
Am Socraithe vs Cineál Samplach
Féadfaidh an t-am socraithe optamach athrú ag brath ar an gcineál cille agus nádúr an turgnaimh. Mar shampla, d'fhéadfadh go mbeadh amanna socraithe níos giorra ag teastáil ó chealla imdhíonachta ná samplaí fíocháin. Coigeartaigh an t-am socraithe bunaithe ar riachtanais shonracha an chineáil sampla. Le haghaidh anailíse próitéine dromchla, is leor am socraithe níos giorra (10-15 nóiméad) de ghnáth. Le haghaidh staining intracellular nó anailís DNA, d'fhéadfadh go mbeadh aga socraithe níos faide ag teastáil.
Staining After Fixation
Tar éis na cealla a shocrú, is céim ríthábhachtach é staining le antasubstaintí nó ruaimeanna fluaraiseacha in anailís cíteiméadrachta sreafa. Is féidir le roinnt ruaimeanna fluaraiseacha, go háirithe ruaimeanna tandem, a bheith íogair ó thaobh fosaithe agus d’fhéadfaidís díghrádú má bhíonn na cealla ró-sheasaithe. Chun na torthaí is fearr is féidir a ruaimniú, moltar na cealla a ruaimniú roimh shocrú nuair is féidir. Is féidir leis seo cabhrú le díghrádú ruaime a chosc agus comharthaí fluaraiseachta níos láidre a chinntiú.
Cealla Seasta a Stóráil le haghaidh Cíteiméadracht Sreabhadh
Stóráil Gearrthéarmach
Le haghaidh stórála gearrthéarmach, is féidir cealla seasta a stóráil sa chuisneoir ag 2-8 ° C. Tá sé seo oiriúnach nuair a bheartaíonn tú anailís a dhéanamh ar na cealla laistigh de lá nó dhó tar éis an fosúchán. Stóráil cealla seasta sa dorchadas i gcónaí chun fótableaching a chosc, rud a chuireann isteach ar na comharthaí fluaraiseacha.
Stóráil Fadtéarmach
Le haghaidh stórála fadtéarmach, is féidir cealla a reoite i meáin cryopreservation. Is éard atá i meán tipiciúil cryopchoimeádta ná 10% sulfocsaíd démheitil (DMSO) agus 90% séiream bó féatais (FBS). Mar sin féin, tá réitigh crióchoimeádta saor ó serum cosúil le mFreSR™ nó CryoStor™ CS10 ar fáil freisin agus is féidir iad a úsáid chun saincheisteanna a bhaineann le FBS a sheachaint. Cuidíonn sé seo le hinmharthanacht cille a chothabháil agus cinntíonn sé stóráil chuí.
Gaistí Coitianta le Seachaint i bhFosúchán Cille le haghaidh Cíteiméadracht Sreafa
Éifeachtaí Fosúchán Míchuí
Féadfaidh roinnt fadhbanna a bheith mar thoradh ar shocrú míchuí, lena n-áirítear uathfhluaraiseacht, laghdú ar cheangal antasubstainte, agus droch-inmharthanacht cille. Is féidir leis na saincheisteanna seo difear suntasach a dhéanamh ar chruinneas agus ar iontaofacht na dtorthaí citeiméadracht sreafa. Fíoraigh i gcónaí prótacail shocraithe do do chineál samplach sonrach, agus cinntigh go bhfuil na coinníollacha socraithe oiriúnach don chineál cille agus na marcóirí atá á anailísiú.
An Réiteach Ceart a Roghnú do D'Iarratas
Tá sé ríthábhachtach an fostóir cuí a roghnú do do thurgnamh cíteaiméadrachta sreafa chun torthaí iontaofa agus cruinne a fháil. Tá daingneáin éagsúla oiriúnach níos fearr d'iarratais éagsúla. Mar shampla, úsáidtear PFA go coitianta le haghaidh anailíse próitéine dromchla, cé go bhfuil eatánól oiriúnach le haghaidh staidéir DNA-bhunaithe. Sula dtosaíonn tú ar an turgnamh, déan taighde ar an fixative is fearr do d'iarratas ar leith agus coigeartaigh an prótacal socraithe dá réir sin.
Conclúid
Tá fosúchán cille cuí riachtanach chun anailís chíteiméadrachta sreafa rathúil a bhaint amach. Cuidíonn sé le struchtúir cheallacha a chaomhnú agus cinntíonn sé sláine próitéiní agus DNA. Trí phrótacail chuí socraithe a leanúint agus ró-shocrú a sheachaint, is féidir le taighdeoirí cruinneas agus iontaofacht sonraí a fheabhsú. Má roghnaítear an fostóir cuí do do thurgnamh feabhsaítear cáilíocht iomlán do thorthaí. Trí na cleachtais is fearr seo a chur i bhfeidhm, cinntítear go soláthraíonn d’anailís cíteaiméadrachta sreafa léargais chomhsheasmhacha in-atáirgthe ar fheidhmeanna ceallacha.
Tá ról lárnach ag fosúchán cille cuí i gcíteiméadracht sreafa, agus i dtáirgí ó Cuireann Hkeybio réitigh iontaofa ar fáil. Cinntíonn a dtairiscintí torthaí ardchaighdeáin agus tá muinín ag taighdeoirí ar fud an domhain orthu le haghaidh anailís chruinn ar chealla.
CCanna
C: Cad é an tábhacht a bhaineann le fosúchán cille i gcíteiméadracht sreafa?
A: Tá fosúchán cille ríthábhachtach i gcíteiméadracht sreafa toisc go gcaomhnaíonn sé struchtúir cheallacha agus cinntíonn sé sláine próitéiní agus DNA le haghaidh anailís chruinn.
C: Cé chomh fada agus ba chóir cealla a shocrú le haghaidh cíteiméadracht sreafa?
A: De ghnáth ba chóir cealla a shocrú ar feadh 15-30 nóiméad le tuaslagán paraformaildéad 2-4% (PFA) chun sláine cheallacha a choinneáil.
C: An féidir liom eatánól a úsáid le haghaidh fosúchán cille i gcíteiméadracht sreafa?
A: Sea, úsáidtear fosúchán eatánóil go coitianta le haghaidh anailíse ar ábhar DNA i gcíteiméadracht sreafa, go háirithe le haghaidh staidéir timthriall cille.
C: Cad a tharlaíonn má tá cealla ró-shocraithe i gcíteiméadracht sreafa?
A: Is féidir le ró-shocrú a bheith ina chúis le tras-nascadh iomarcach, rud a fhágann go n-eascraíonn autofluorescence agus droch-cheangal antasubstainte, rud a d'fhéadfadh tionchar a bheith aige ar thorthaí cítoiméadracht sreafa.
