Panimula
Naisip mo na ba kung paano ang daloy ng cytometry ay nakakamit ng ganoong tumpak at maaasahang pagsusuri ng cell? Ang susi sa tumpak na mga resulta ay nakasalalay sa tamang pag-aayos ng cell. Ang flow cytometry ay nagpapahintulot sa mga mananaliksik na pag-aralan ang iba't ibang katangian ng cellular, mula sa laki hanggang sa intensity ng fluorescence. Gayunpaman, nang walang wastong pag-aayos, maaaring hindi ipakita ng data ang mga tunay na katangian ng cellular. Sa artikulong ito, tutuklasin natin ang kahalagahan ng cell fixation sa flow cytometry, tatalakayin ang iba't ibang paraan ng fixation, at magbabahagi ng mga tip para sa pinakamainam na resulta.
Ano ang Cell Fixation sa Flow Cytometry?
Kahulugan ng Cell Fixation
Ang pag-aayos ng cell ay isang proseso na nagpapatatag at nagpapanatili ng mga selula sa pamamagitan ng pagpigil sa mga pagbabago sa kanilang istraktura, pag-andar, at komposisyon ng molekular. Ang prosesong ito ay nakakamit sa pamamagitan ng kemikal na cross-linking na mga protina, lipid, at iba pang bahagi ng cellular, na epektibong 'pinalamig' ang mga selula sa kanilang kasalukuyang estado. Ito ay partikular na mahalaga sa daloy ng cytometry dahil pinipigilan nito ang pagkasira ng mga cellular marker o ang pagbabago ng mga istruktura ng cellular sa panahon ng pagsusuri. Sa pamamagitan ng pag-aayos ng mga cell, matitiyak ng mga mananaliksik na ang mga katangian ng mga cell ay mananatiling pare-pareho, na nagbibigay-daan para sa tumpak na mga sukat at maaasahang data sa panahon ng pagsusuri ng daloy ng cytometry.
Bakit Mahalaga ang Fixation
Ang wastong pag-aayos ay mahalaga dahil pinapanatili nito ang integridad ng mga cellular protein at nucleic acid, na mahalaga para sa tumpak na pagsusuri ng cytometry ng daloy. Kung ang mga cell ay hindi naayos, ang kanilang istraktura at mga molekular na marker ay maaaring bumaba o magbago sa paglipas ng panahon, na humahantong sa hindi maaasahan at hindi tumpak na mga resulta. Ang pag-aayos ay gumaganap din ng isang kritikal na papel sa pag-stabilize ng mga cell para sa pagsusuri ng multi-parameter, na isa sa mga pangunahing lakas ng daloy ng cytometry. Nagbibigay-daan ito sa mga mananaliksik na sabay-sabay na masuri ang maramihang mga tampok ng cell, tulad ng mga marker sa ibabaw, mga intracellular na protina, at nilalaman ng DNA, sa isang eksperimento. Kung walang wastong pag-aayos, ang data na nakuha ay maaaring hindi naaayon o hindi kumpleto, na humahantong sa maling interpretasyon ng mga eksperimentong kinalabasan.
Mga Uri ng Paraan ng Pag-aayos para sa Flow Cytometry
Paraformaldehyde (PFA) Fixation
Ang Paraformaldehyde (PFA) ay isa sa pinakamalawak na ginagamit na fixative sa flow cytometry, pangunahin dahil sa pagiging epektibo nito sa pagpapanatili ng cell morphology at antigenicity. Gumagana ito sa pamamagitan ng pag-cross-link ng mga protina sa loob ng mga selula, na tinitiyak na mananatiling buo ang istraktura ng cellular at mga protina sa ibabaw. Ginagawa nitong mahusay na pagpipilian ang PFA para sa pagpapanatili ng mga marker sa ibabaw ng cell, lalo na kapag sinusuri ang expression ng protina sa ibabaw sa mga eksperimento sa immunophenotyping.
Rekomendasyon:
● Konsentrasyon: 2-4% PFA ay karaniwang ginagamit para sa pinakamainam na pag-aayos.
● Oras ng Pag-aayos: Ang mga cell ay dapat na incubated sa PFA sa loob ng 15-30 minuto sa 2-8°C.
● Storage: Pagkatapos ng fixation, ang mga cell ay dapat na nakaimbak sa 2-8°C para sa panandaliang imbakan. Mahalagang huwag mag-imbak ng mga nakapirming cell sa loob ng mahabang panahon, dahil maaaring humantong ito sa pagkawala ng integridad ng marker.
Mahalagang maiwasan ang sobrang pag-aayos, dahil ang matagal na pagkakalantad sa PFA ay maaaring humantong sa cellular autofluorescence at makagambala sa kasunod na paglamlam at pagsusuri. Palaging gamitin ang kaunting kinakailangang tagal ng oras para sa pag-aayos.
Pag-aayos ng Ethanol
Ang pag-aayos ng ethanol ay karaniwang ginagamit kapag ang pokus ng pagsusuri ay nasa nilalaman ng DNA, tulad ng sa mga pag-aaral ng cell cycle. Ang ethanol ay isang dehydrating agent na gumagana sa pamamagitan ng pagtagos sa cell membrane at pagpreserba ng DNA sa loob ng mga cell. Ginagawa nitong partikular na kapaki-pakinabang ang pag-aayos ng ethanol para sa mga pagsusuring nakabatay sa DNA at mga pagsusuri ng flow cytometry kung saan sinusuri ang mga yugto ng cell cycle o nilalaman ng DNA.
Rekomendasyon:
● Konsentrasyon: Karaniwan, 70-100% ethanol ang ginagamit.
● Oras ng Pag-aayos: Ang pag-aayos ng ethanol ay karaniwang nangangailangan ng 10-15 minuto para sa mga pinakamainam na resulta.
Ang pag-aayos ng ethanol ay mainam para sa pagpepreserba ng mga yugto ng cell cycle, at maaari itong gamitin kasama ng mga tina na nagbubuklod ng DNA gaya ng propidium iodide (PI) para sa pagsusuri ng cell cycle.
Pag-aayos ng Methanol
Ang methanol ay isa pang karaniwang ginagamit na fixative, lalo na para sa intracellular analysis. Gumagana ito sa pamamagitan ng pagtagos sa lamad ng cell at pagpapatatag ng mga panloob na istruktura ng cell. Bagama't epektibo ang methanol sa pag-iingat ng mga cellular protein at antigens, maaari itong magdulot ng pag-urong ng cell, na maaaring makaapekto sa interpretasyon ng ilang partikular na feature, gaya ng laki ng cell at morphology.
Rekomendasyon:
● Konsentrasyon: Karaniwan, 90-100% methanol ang ginagamit.
● Oras ng Pag-aayos: Karaniwang sapat na ang 10-15 minuto.
Ang pag-aayos ng methanol ay kadalasang ginagamit kapag nag-aaral ng mga intracellular na protina, lalo na kapag sinusuri ang mga marker sa loob ng cytoplasm o nucleus. Gayunpaman, dapat isaalang-alang ng mga mananaliksik ang potensyal para sa pag-urong ng cell kapag gumagamit ng methanol fixation.
Iba pang mga Fixative (hal., Formalin)
Ang Formalin, isang solusyon ng formaldehyde sa tubig, ay isa pang fixative na ginagamit sa flow cytometry, kahit na ito ay hindi gaanong karaniwan kaysa sa PFA. Ang Formalin ay malawakang ginagamit sa histology at immunohistochemistry, kung saan epektibo nitong pinapanatili ang mga sample ng tissue para sa mikroskopikong pagsusuri. Bagama't maaaring mapanatili ng formalin ang mga istruktura ng cell, sa pangkalahatan ay hindi ito inirerekomenda para sa daloy ng cytometry maliban kung nagtatrabaho sa mga nakapirming sample ng tissue, dahil maaari itong makagambala sa pag-uuri ng cell at ilang mga aplikasyon ng fluorescence. Ang pag-aayos ng formalin ay pinakaangkop para sa mga sample ng tissue, hindi para sa mga indibidwal na cell.
Fixative |
Konsentrasyon |
Oras ng Pag-aayos |
Inirerekomendang Paggamit |
Paraformaldehyde (PFA) |
2-4% |
15-30 minuto |
Tamang-tama para sa pagpepreserba ng mga marker sa ibabaw ng cell; karaniwan para sa immunophenotyping |
Ethanol |
70-100% |
10-15 minuto |
Pinakamahusay para sa pagsusuri ng nilalaman ng DNA at pag-aaral ng cell cycle |
Methanol |
90-100% |
10-15 minuto |
Angkop para sa intracellular protein analysis; maaaring maging sanhi ng pag-urong ng cell |
Formalin |
10% (formaldehyde) |
Iba-iba (depende sa tissue) |
Karaniwang ginagamit para sa mga nakapirming sample ng tissue, hindi para sa mga indibidwal na cell |
Step-by-Step na Gabay sa Pag-aayos ng mga Cell para sa Flow Cytometry
Paghahanda ng Cell Sample
Bago ang pag-aayos, mahalagang ihiwalay ang mga selula mula sa tissue o sample ng dugo. Ang centrifugation ay ang pinakakaraniwang paraan na ginagamit para sa pag-concentrate ng mga cell sa isang suspensyon. Mahalaga rin na hugasan ang mga cell nang lubusan upang maalis ang anumang media ng kultura o mga natitirang contaminants, na maaaring makagambala sa proseso ng pag-aayos.
1. Cell Isolation: Gumamit ng mga karaniwang paraan ng paghihiwalay gaya ng centrifugation o cell sorting para paghiwalayin ang mga cell na interesado.
2. Paghuhugas: Hugasan ang mga cell gamit ang phosphate-buffered saline (PBS) upang alisin ang natitirang media at mga kontaminant na maaaring makaapekto sa proseso ng pag-aayos.
Pamamaraan sa Pag-aayos
Kapag handa na ang mga cell, ang susunod na hakbang ay idagdag ang fixative sa suspensyon ng cell. Ang pinakakaraniwang ginagamit na fixative para sa flow cytometry ay isang 2-4% PFA solution.
1. Idagdag ang fixative sa cell suspension, tiyaking maayos itong pinaghalo.
2. I-incubate ang mga cell gamit ang fixative sa loob ng 15-30 minuto sa 2-8°C.
3. Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog, hugasan ang mga cell ng dalawang beses gamit ang PBS upang alisin ang labis na fixative.
Mga Hakbang Pagkatapos ng Pag-aayos
Pagkatapos ng pag-aayos, ang mga cell ay dapat na maingat na hawakan. Kung kailangan ng karagdagang pagsusuri, ang mga cell ay dapat mantsang bago ang pagsusuri. Kung plano mong iimbak ang mga cell para sa pagsusuri sa hinaharap, muling suspindihin ang mga ito sa isang naaangkop na buffer at itago ang mga ito sa 2-8°C. Iwasang mag-iwan ng mga cell sa fixative sa mahabang panahon, dahil ang sobrang pag-aayos ay maaaring humantong sa pagtaas ng autofluorescence at pagbaba ng kalidad ng signal.
Mga Tip para sa Pinakamainam na Pag-aayos sa Flow Cytometry
Pag-iwas sa Over-Fixation
Ang over-fixation ay nangyayari kapag ang mga cell ay na-expose sa fixative nang masyadong mahaba, na maaaring magresulta sa labis na cross-linking ng mga cellular protein at makompromiso ang kalidad ng data. Maaari itong humantong sa autofluorescence, pagbawas ng antibody binding, at hindi tumpak na mga sukat ng cytometry ng daloy. Palaging suriin ang mga inirerekomendang oras ng pag-aayos para sa iyong partikular na uri ng cell at eksperimento upang maiwasan ang sobrang pag-aayos.
Oras ng Pag-aayos kumpara sa Uri ng Sample
Ang pinakamainam na oras ng pag-aayos ay maaaring mag-iba depende sa uri ng cell at likas na katangian ng eksperimento. Halimbawa, ang mga immune cell ay maaaring mangailangan ng mas maikling oras ng pag-aayos kaysa sa mga sample ng tissue. Ayusin ang oras ng pag-aayos batay sa mga partikular na pangangailangan ng uri ng sample. Para sa pagsusuri ng protina sa ibabaw, ang isang mas maikling oras ng pag-aayos (10-15 minuto) ay karaniwang sapat. Para sa intracellular staining o pagsusuri sa DNA, maaaring kailanganin ang mas mahabang oras ng pag-aayos.
Paglamlam Pagkatapos ng Fixation
Pagkatapos ayusin ang mga cell, ang paglamlam ng mga antibodies o fluorescent dyes ay isang kritikal na hakbang sa pagsusuri ng daloy ng cytometry. Ang ilang mga fluorescent dyes, partikular na ang tandem dyes, ay maaaring maging sensitibo sa fixation at maaaring bumaba kung ang mga cell ay over-fixed. Para sa pinakamainam na resulta ng paglamlam, inirerekumenda na mantsang ang mga cell bago ang fixation hangga't maaari. Makakatulong ito na maiwasan ang pagkasira ng dye at matiyak ang mas malakas na signal ng fluorescence.
Pag-iimbak ng Mga Fixed Cell para sa Flow Cytometry
Panandaliang Imbakan
Para sa panandaliang pag-iimbak, ang mga nakapirming cell ay maaaring iimbak sa refrigerator sa 2-8°C. Ito ay perpekto kapag plano mong pag-aralan ang mga cell sa loob ng isang araw o dalawa pagkatapos ng pag-aayos. Palaging mag-imbak ng mga fixed cell sa dilim upang maiwasan ang photobleaching, na maaaring makaapekto sa mga fluorescent signal.
Pangmatagalang Imbakan
Para sa pangmatagalang imbakan, ang mga cell ay maaaring i-freeze sa cryopreservation media. Ang isang tipikal na cryopreservation medium ay binubuo ng 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) at 90% fetal bovine serum (FBS). Gayunpaman, available din ang mga serum-free cryopreservation solution tulad ng mFreSR™ o CryoStor™ CS10 at magagamit para maiwasan ang mga isyung nauugnay sa FBS. Para maiwasan ang pagbuo ng ice crystal, gumamit ng controlled-rate freezer para i-freeze ang mga cell. Nakakatulong ito sa pagpapanatili ng cell viability at tinitiyak ang wastong imbakan.
Mga Karaniwang Pitfalls na Dapat Iwasan sa Cell Fixation para sa Flow Cytometry
Mga Epekto ng Hindi Wastong Pag-aayos
Ang hindi tamang pag-aayos ay maaaring humantong sa ilang mga problema, kabilang ang autofluorescence, nabawasan ang pag-iikot ng antibody, at mahinang cell viability. Ang mga isyung ito ay maaaring makabuluhang makaapekto sa katumpakan at pagiging maaasahan ng mga resulta ng daloy ng cytometry. Palaging i-verify ang mga protocol ng pag-aayos para sa iyong partikular na uri ng sample, at tiyaking naaangkop ang mga kundisyon ng pag-aayos para sa uri ng cell at mga marker na sinusuri.
Pagpili ng Tamang Fixative para sa Iyong Aplikasyon
Ang pagpili ng naaangkop na fixative para sa iyong flow cytometry na eksperimento ay mahalaga para sa pagkuha ng maaasahan at tumpak na mga resulta. Ang iba't ibang mga fixative ay mas angkop para sa iba't ibang mga aplikasyon. Halimbawa, ang PFA ay karaniwang ginagamit para sa pagsusuri sa surface protein, habang ang ethanol ay perpekto para sa DNA-based na pag-aaral. Bago simulan ang eksperimento, saliksikin ang pinakamahusay na fixative para sa iyong partikular na aplikasyon at ayusin ang fixation protocol nang naaayon.
Konklusyon
Ang wastong pag-aayos ng cell ay mahalaga para sa pagkamit ng matagumpay na pagsusuri ng cytometry ng daloy. Nakakatulong ito na mapanatili ang mga istruktura ng cellular at tinitiyak ang integridad ng mga protina at DNA. Sa pamamagitan ng pagsunod sa wastong mga protocol sa pag-aayos at pag-iwas sa sobrang pag-aayos, maaaring mapahusay ng mga mananaliksik ang katumpakan at pagiging maaasahan ng data. Ang pagpili ng naaangkop na fixative para sa iyong eksperimento ay nagpapabuti sa pangkalahatang kalidad ng iyong mga resulta. Ang pagpapatupad ng mga pinakamahuhusay na kagawian na ito ay nagsisiguro na ang iyong pagsusuri sa daloy ng cytometry ay nagbibigay ng pare-pareho, maaaring muling gawin na mga insight sa mga cellular function.
Ang wastong pag-aayos ng cell ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa daloy ng cytometry, at mga produkto mula sa Nag-aalok ang HKeybio ng mga maaasahang solusyon. Tinitiyak ng kanilang mga alok ang mataas na kalidad na mga resulta at pinagkakatiwalaan ng mga mananaliksik sa buong mundo para sa tumpak na pagsusuri sa cell.
FAQ
Q: Ano ang kahalagahan ng cell fixation sa flow cytometry?
A: Ang pag-aayos ng cell ay mahalaga sa daloy ng cytometry dahil pinapanatili nito ang mga istruktura ng cellular at tinitiyak ang integridad ng mga protina at DNA para sa tumpak na pagsusuri.
Q: Gaano katagal dapat ayusin ang mga cell para sa flow cytometry?
A: Karaniwang dapat ayusin ang mga cell sa loob ng 15-30 minuto gamit ang 2-4% paraformaldehyde (PFA) na solusyon upang mapanatili ang integridad ng cellular.
T: Maaari ba akong gumamit ng ethanol para sa pag-aayos ng cell sa flow cytometry?
A: Oo, ang ethanol fixation ay karaniwang ginagamit para sa pagsusuri ng nilalaman ng DNA sa flow cytometry, lalo na para sa pag-aaral ng cell cycle.
Q: Ano ang mangyayari kung ang mga cell ay over-fixed sa flow cytometry?
A: Ang sobrang pag-aayos ay maaaring magdulot ng labis na cross-linking, na humahantong sa autofluorescence at mahinang antibody binding, na maaaring makaapekto sa mga resulta ng flow cytometry.
