pengenalan
Pernahkah anda terfikir bagaimana sitometri aliran mencapai analisis sel yang tepat dan boleh dipercayai? Kunci kepada keputusan yang tepat terletak pada penetapan sel yang betul. Sitometri aliran membolehkan penyelidik mengkaji pelbagai ciri selular, daripada saiz kepada intensiti pendarfluor. Walau bagaimanapun, tanpa penetapan yang betul, data mungkin tidak mencerminkan sifat selular sebenar. Dalam artikel ini, kami akan meneroka kepentingan penetapan sel dalam sitometri aliran, membincangkan kaedah penetapan yang berbeza dan berkongsi petua untuk hasil yang optimum.
Apakah Penetapan Sel dalam Sitometri Aliran?
Definisi Penetapan Sel
Penetapan sel ialah proses yang menstabilkan dan memelihara sel dengan menghalang perubahan dalam struktur, fungsi dan komposisi molekulnya. Proses ini dicapai dengan protein pautan silang secara kimia, lipid dan komponen selular lain, dengan berkesan 'membekukan' sel dalam keadaan semasanya. Ini amat penting dalam sitometri aliran kerana ia menghalang kemerosotan penanda selular atau perubahan struktur selular semasa analisis. Dengan membetulkan sel, penyelidik boleh memastikan bahawa ciri-ciri sel kekal konsisten, yang membolehkan pengukuran yang tepat dan data yang boleh dipercayai semasa analisis sitometri aliran.
Mengapa Penetapan Penting
Penetapan yang betul adalah penting kerana ia mengekalkan integriti protein selular dan asid nukleik, yang penting untuk analisis sitometri aliran yang tepat. Jika sel tidak diperbaiki, struktur dan penanda molekulnya mungkin merosot atau berubah dari semasa ke semasa, membawa kepada keputusan yang tidak boleh dipercayai dan tidak tepat. Penetapan juga memainkan peranan penting dalam menstabilkan sel untuk analisis berbilang parameter, yang merupakan salah satu kekuatan utama sitometri aliran. Ia membolehkan penyelidik menilai berbilang ciri sel secara serentak, seperti penanda permukaan, protein intraselular dan kandungan DNA, dalam satu eksperimen. Tanpa penetapan yang betul, data yang diperoleh mungkin tidak konsisten atau tidak lengkap, yang membawa kepada salah tafsiran hasil eksperimen.
Jenis Kaedah Penetapan untuk Sitometri Aliran
Penetapan Paraformaldehid (PFA).
Paraformaldehyde (PFA) ialah salah satu fiksatif yang paling banyak digunakan dalam sitometri aliran, terutamanya kerana keberkesanannya dalam memelihara morfologi sel dan antigenisiti. Ia berfungsi dengan menghubungkan protein silang dalam sel, memastikan kedua-dua struktur selular dan protein permukaan kekal utuh. Ini menjadikan PFA pilihan yang sangat baik untuk memelihara penanda permukaan sel, terutamanya apabila menganalisis ekspresi protein permukaan dalam eksperimen immunophenotyping.
Syor:
● Kepekatan: 2-4% PFA biasanya digunakan untuk penetapan optimum.
● Masa Penetapan: Sel hendaklah diinkubasi dalam PFA selama 15-30 minit pada 2-8°C.
● Penyimpanan: Selepas penetapan, sel hendaklah disimpan pada suhu 2-8°C untuk penyimpanan jangka pendek. Adalah penting untuk tidak menyimpan sel tetap untuk tempoh yang lama, kerana ini boleh menyebabkan kehilangan integriti penanda.
Adalah penting untuk mengelakkan penetapan berlebihan, kerana pendedahan yang berpanjangan kepada PFA boleh membawa kepada autofluoresensi selular dan mengganggu pewarnaan dan analisis seterusnya. Sentiasa gunakan jumlah masa minimum yang diperlukan untuk penetapan.
Penetapan Etanol
Penetapan etanol biasanya digunakan apabila fokus analisis adalah pada kandungan DNA, seperti dalam kajian kitaran sel. Etanol ialah agen penyahhidratan yang berfungsi dengan menembusi membran sel dan memelihara DNA dalam sel. Ini menjadikan penetapan etanol amat berguna untuk ujian berasaskan DNA dan analisis sitometri aliran di mana peringkat kitaran sel atau kandungan DNA sedang diperiksa.
Syor:
● Kepekatan: Biasanya, 70-100% etanol digunakan.
● Masa Penetapan: Penetapan etanol biasanya memerlukan 10-15 minit untuk hasil yang optimum.
Penetapan etanol sesuai untuk memelihara fasa kitaran sel, dan ia boleh digunakan dalam kombinasi dengan pewarna pengikat DNA seperti propidium iodide (PI) untuk analisis kitaran sel.
Penetapan Metanol
Metanol adalah satu lagi fiksatif yang biasa digunakan, terutamanya untuk analisis intrasel. Ia berfungsi dengan menembusi membran sel dan menstabilkan struktur dalaman sel. Walaupun metanol berkesan dalam memelihara protein dan antigen selular, ia boleh menyebabkan pengecutan sel, yang mungkin memberi kesan kepada tafsiran ciri tertentu, seperti saiz sel dan morfologi.
Syor:
● Kepekatan: Biasanya, 90-100% metanol digunakan.
● Masa Penetapan: 10-15 minit biasanya mencukupi.
Penetapan metanol sering digunakan semasa mengkaji protein intraselular, terutamanya apabila memeriksa penanda di dalam sitoplasma atau nukleus. Walau bagaimanapun, penyelidik harus mempertimbangkan potensi pengecutan sel apabila menggunakan penetapan metanol.
Fiksatif Lain (cth, Formalin)
Formalin, larutan formaldehid dalam air, adalah satu lagi fiksatif yang digunakan dalam sitometri aliran, walaupun ia kurang biasa daripada PFA. Formalin digunakan secara meluas dalam histologi dan imunohistokimia, di mana ia berkesan memelihara sampel tisu untuk analisis mikroskopik. Walaupun formalin boleh mengekalkan struktur sel, ia biasanya tidak disyorkan untuk sitometri aliran melainkan bekerja dengan sampel tisu tetap, kerana ia boleh mengganggu pengisihan sel dan beberapa aplikasi pendarfluor. Penetapan formalin paling sesuai untuk sampel tisu, bukan untuk sel individu.
Fixative |
penumpuan |
Masa Penetapan |
Penggunaan yang Disyorkan |
Paraformaldehid (PFA) |
2-4% |
15-30 minit |
Ideal untuk memelihara penanda permukaan sel; biasa untuk immunophenotyping |
Etanol |
70-100% |
10-15 minit |
Terbaik untuk analisis kandungan DNA dan kajian kitaran sel |
Metanol |
90-100% |
10-15 minit |
Sesuai untuk analisis protein intraselular; boleh menyebabkan pengecutan sel |
Formalin |
10% (formaldehid) |
Berbeza (bergantung pada tisu) |
Biasanya digunakan untuk sampel tisu tetap, bukan untuk sel individu |
Panduan Langkah demi Langkah untuk Membetulkan Sel untuk Sitometri Aliran
Menyediakan Sampel Sel
Sebelum penetapan, adalah penting untuk mengasingkan sel daripada tisu atau sampel darah. Sentrifugasi adalah kaedah yang paling biasa digunakan untuk menumpukan sel dalam ampaian. Ia juga penting untuk mencuci sel dengan teliti untuk membuang sebarang media kultur atau sisa bahan cemar, yang boleh mengganggu proses penetapan.
1. Pengasingan Sel: Gunakan kaedah pengasingan standard seperti sentrifugasi atau pengasingan sel untuk mengasingkan sel yang diminati.
2. Mencuci: Basuh sel dengan garam penimbal fosfat (PBS) untuk membuang sisa media dan bahan cemar yang boleh menjejaskan proses penetapan.
Prosedur Penetapan
Sebaik sahaja sel disediakan, langkah seterusnya ialah menambah fiksatif pada penggantungan sel. Fiksatif yang paling biasa digunakan untuk sitometri aliran ialah penyelesaian PFA 2-4%.
1. Tambah fiksatif pada penggantungan sel, pastikan ia bercampur dengan baik.
2. Inkubasi sel dengan fiksatif selama 15-30 minit pada suhu 2-8°C.
3. Selepas pengeraman, basuh sel dua kali dengan PBS untuk membuang fiksatif berlebihan.
Langkah Selepas Penetapan
Selepas penetapan, sel-sel mesti dikendalikan dengan berhati-hati. Jika analisis lanjut diperlukan, sel harus diwarnakan sebelum analisis. Jika anda bercadang untuk menyimpan sel untuk analisis masa hadapan, gantungkan semula dalam penimbal yang sesuai dan simpan pada suhu 2-8°C. Elakkan meninggalkan sel dalam fiksatif untuk tempoh yang lama, kerana penetapan berlebihan boleh menyebabkan peningkatan autofluoresensi dan kualiti isyarat yang berkurangan.
Petua untuk Penetapan Optimum dalam Sitometri Aliran
Mengelakkan Terlalu Menetap
Penetapan berlebihan berlaku apabila sel terdedah kepada penetapan terlalu lama, yang boleh mengakibatkan pemautan silang protein selular yang berlebihan dan menjejaskan kualiti data. Ini boleh membawa kepada pendarfluor auto, pengikatan antibodi yang berkurangan dan ukuran sitometri aliran yang tidak tepat. Sentiasa semak masa penetapan yang disyorkan untuk jenis sel dan percubaan khusus anda untuk mengelakkan penetapan berlebihan.
Masa Penetapan lwn. Jenis Sampel
Masa penetapan optimum mungkin berbeza-beza bergantung pada jenis sel dan sifat eksperimen. Sebagai contoh, sel imun mungkin memerlukan masa penetapan yang lebih pendek daripada sampel tisu. Laraskan masa penetapan berdasarkan keperluan khusus jenis sampel. Untuk analisis protein permukaan, masa penetapan yang lebih pendek (10-15 minit) biasanya mencukupi. Untuk pewarnaan intraselular atau analisis DNA, masa penetapan yang lebih lama mungkin diperlukan.
Pewarnaan Selepas Penetapan
Selepas membetulkan sel, pewarnaan dengan antibodi atau pewarna pendarfluor adalah langkah kritikal dalam analisis sitometri aliran. Sesetengah pewarna pendarfluor, terutamanya pewarna tandem, boleh menjadi sensitif kepada penetapan dan mungkin merosot jika sel-sel terlampau tetap. Untuk hasil pewarnaan yang optimum, adalah disyorkan untuk mengotorkan sel sebelum penetapan apabila boleh. Ini boleh membantu mencegah degradasi pewarna dan memastikan isyarat pendarfluor yang lebih kuat.
Menyimpan Sel Tetap untuk Sitometri Aliran
Storan Jangka Pendek
Untuk penyimpanan jangka pendek, sel tetap boleh disimpan di dalam peti sejuk pada suhu 2-8°C. Ini sesuai apabila anda merancang untuk menganalisis sel dalam satu atau dua hari selepas penetapan. Sentiasa simpan sel tetap dalam gelap untuk mengelakkan pelunturan foto, yang boleh menjejaskan isyarat pendarfluor.
Storan Jangka Panjang
Untuk penyimpanan jangka panjang, sel boleh dibekukan dalam media cryopreservation. Medium cryopreservation biasa terdiri daripada 10% dimetil sulfoksida (DMSO) dan 90% serum lembu janin (FBS). Walau bagaimanapun, penyelesaian cryopreservation bebas serum seperti mFreSR™ atau CryoStor™ CS10 juga tersedia dan boleh digunakan untuk mengelakkan isu yang berkaitan dengan FBS. Untuk mengelakkan pembentukan kristal ais, gunakan penyejuk beku kadar terkawal untuk membekukan sel. Ini membantu mengekalkan daya maju sel dan memastikan penyimpanan yang betul.
Perangkap Biasa yang Perlu Dielakkan dalam Penetapan Sel untuk Sitometri Aliran
Kesan Penetapan Tidak Betul
Penetapan yang tidak betul boleh membawa kepada beberapa masalah, termasuk autofluoresensi, pengikatan antibodi yang berkurangan dan daya maju sel yang lemah. Isu-isu ini boleh menjejaskan ketepatan dan kebolehpercayaan keputusan sitometri aliran dengan ketara. Sentiasa sahkan protokol penetapan untuk jenis sampel khusus anda dan pastikan keadaan penetapan sesuai untuk jenis sel dan penanda yang dianalisis.
Memilih Fixative yang Tepat untuk Permohonan Anda
Memilih fiksatif yang sesuai untuk eksperimen sitometri aliran anda adalah penting untuk mendapatkan hasil yang boleh dipercayai dan tepat. Fiksatif yang berbeza lebih sesuai untuk aplikasi yang berbeza. Sebagai contoh, PFA biasanya digunakan untuk analisis protein permukaan, manakala etanol sesuai untuk kajian berasaskan DNA. Sebelum memulakan eksperimen, selidiki fiksatif terbaik untuk aplikasi khusus anda dan laraskan protokol penetapan dengan sewajarnya.
Kesimpulan
Penetapan sel yang betul adalah penting untuk mencapai analisis sitometri aliran yang berjaya. Ia membantu memelihara struktur selular dan memastikan integriti protein dan DNA. Dengan mengikuti protokol penetapan yang betul dan mengelakkan penetapan berlebihan, penyelidik boleh meningkatkan ketepatan dan kebolehpercayaan data. Memilih fiksatif yang sesuai untuk percubaan anda meningkatkan kualiti keseluruhan keputusan anda. Melaksanakan amalan terbaik ini memastikan analisis sitometri aliran anda memberikan cerapan yang konsisten dan boleh dihasilkan semula ke dalam fungsi selular.
Penetapan sel yang betul memainkan peranan penting dalam sitometri aliran, dan produk daripada HKeybio menawarkan penyelesaian yang boleh dipercayai. Tawaran mereka memastikan hasil yang berkualiti tinggi dan dipercayai oleh penyelidik di seluruh dunia untuk analisis sel yang tepat.
Soalan Lazim
S: Apakah kepentingan penetapan sel dalam sitometri aliran?
J: Penetapan sel adalah penting dalam sitometri aliran kerana ia mengekalkan struktur selular dan memastikan integriti protein dan DNA untuk analisis yang tepat.
S: Berapa lama sel perlu diperbaiki untuk sitometri aliran?
J: Sel biasanya harus diperbaiki selama 15-30 minit dengan larutan paraformaldehid (PFA) 2-4% untuk mengekalkan integriti selular.
S: Bolehkah saya menggunakan etanol untuk penetapan sel dalam sitometri aliran?
J: Ya, penetapan etanol biasanya digunakan untuk analisis kandungan DNA dalam sitometri aliran, terutamanya untuk kajian kitaran sel.
S: Apakah yang berlaku jika sel-sel terlalu tetap dalam sitometri aliran?
J: Penetapan berlebihan boleh menyebabkan pemautan silang yang berlebihan, yang membawa kepada autofluoresensi dan pengikatan antibodi yang lemah, yang mungkin menjejaskan keputusan sitometri aliran.
