Introduktion
Har du någonsin undrat hur flödescytometri uppnår en sådan exakt och tillförlitlig cellanalys? Nyckeln till korrekta resultat ligger i korrekt cellfixering. Flödescytometri tillåter forskare att studera en mängd olika cellulära egenskaper, från storlek till fluorescensintensitet. Utan korrekt fixering kanske data inte återspeglar verkliga cellulära egenskaper. I den här artikeln kommer vi att utforska vikten av cellfixering i flödescytometri, diskutera olika fixeringsmetoder och dela tips för optimala resultat.
Vad är cellfixering i flödescytometri?
Definition av cellfixering
Cellfixering är en process som stabiliserar och bevarar cellerna genom att förhindra förändringar i deras struktur, funktion och molekylära sammansättning. Denna process uppnås genom att kemiskt tvärbinda proteiner, lipider och andra cellulära komponenter, effektivt 'frysa' cellerna i deras nuvarande tillstånd. Detta är särskilt viktigt vid flödescytometri eftersom det förhindrar nedbrytning av cellulära markörer eller förändring av cellulära strukturer under analysen. Genom att fixera cellerna kan forskarna säkerställa att cellernas egenskaper förblir konsekventa, vilket möjliggör exakta mätningar och tillförlitliga data under flödescytometrianalys.
Varför fixering är viktigt
Korrekt fixering är viktigt eftersom det upprätthåller integriteten hos cellulära proteiner och nukleinsyror, vilket är avgörande för korrekt flödescytometrianalys. Om celler inte fixeras kan deras struktur och molekylära markörer försämras eller förändras över tiden, vilket leder till opålitliga och felaktiga resultat. Fixering spelar också en avgörande roll för att stabilisera celler för multiparameteranalys, vilket är en av de viktigaste styrkorna med flödescytometri. Det gör det möjligt för forskare att samtidigt bedöma flera cellegenskaper, såsom ytmarkörer, intracellulära proteiner och DNA-innehåll, i ett enda experiment. Utan korrekt fixering kan de erhållna uppgifterna vara inkonsekventa eller ofullständiga, vilket leder till feltolkning av de experimentella resultaten.
Typer av fixeringsmetoder för flödescytometri
Paraformaldehyd (PFA) Fixering
Paraformaldehyd (PFA) är ett av de mest använda fixativen inom flödescytometri, främst på grund av dess effektivitet för att bevara cellmorfologi och antigenicitet. Det fungerar genom att tvärbinda proteiner i cellerna, vilket säkerställer att både cellstrukturen och ytproteinerna förblir intakta. Detta gör PFA till ett utmärkt val för att bevara cellytmarkörer, särskilt när man analyserar ytproteinuttryck i immunfenotypningsexperiment.
Rekommendation:
● Koncentration: 2-4 % PFA används vanligtvis för optimal fixering.
● Fixeringstid: Celler bör inkuberas i PFA i 15-30 minuter vid 2-8°C.
● Förvaring: Efter fixering bör cellerna förvaras vid 2-8°C för korttidsförvaring. Det är viktigt att inte lagra fasta celler under längre perioder, eftersom detta kan leda till förlust av markörintegritet.
Det är viktigt att undvika överfixering, eftersom långvarig exponering för PFA kan leda till cellulär autofluorescens och störa efterföljande färgning och analys. Använd alltid den minimala tiden som krävs för fixering.
Etanolfixering
Etanolfixering används ofta när fokus för analysen ligger på DNA-innehåll, såsom i cellcykelstudier. Etanol är ett uttorkningsmedel som verkar genom att penetrera cellmembranet och bevara DNA i cellerna. Detta gör etanolfixering särskilt användbart för DNA-baserade analyser och flödescytometrianalyser där cellcykelstadier eller DNA-innehåll undersöks.
Rekommendation:
● Koncentration: Vanligtvis används 70-100 % etanol.
● Fixeringstid: Etanolfixering kräver vanligtvis 10-15 minuter för optimalt resultat.
Etanolfixering är idealisk för att bevara cellcykelfaser, och den kan användas i kombination med DNA-bindande färgämnen som propidiumjodid (PI) för cellcykelanalys.
Metanolfixering
Metanol är ett annat vanligt använda fixativ, speciellt för intracellulära analyser. Det fungerar genom att penetrera cellmembranet och stabilisera cellens inre strukturer. Även om metanol är effektivt för att bevara cellulära proteiner och antigener, kan det orsaka cellkrympning, vilket kan påverka tolkningen av vissa egenskaper, såsom cellstorlek och morfologi.
Rekommendation:
● Koncentration: Vanligtvis används 90-100 % metanol.
● Fixeringstid: 10-15 minuter är vanligtvis tillräckligt.
Metanolfixering används ofta när man studerar intracellulära proteiner, särskilt när man undersöker markörer inuti cytoplasman eller kärnan. Men forskare bör överväga potentialen för cellkrympning när man använder metanolfixering.
Andra fixeringsmedel (t.ex. formalin)
Formalin, en lösning av formaldehyd i vatten, är ett annat fixativ som används i flödescytometri, även om det är mindre vanligt än PFA. Formalin används ofta inom histologi och immunhistokemi, där det effektivt bevarar vävnadsprover för mikroskopisk analys. Även om formalin kan bevara cellstrukturer, rekommenderas det i allmänhet inte för flödescytometri om det inte arbetar med fixerade vävnadsprover, eftersom det kan störa cellsortering och vissa fluorescensapplikationer. Formalinfixering är bäst lämpad för vävnadsprover, inte för enskilda celler.
Fixativ |
Koncentration |
Fixeringstid |
Rekommenderad användning |
Paraformaldehyd (PFA) |
2-4 % |
15-30 minuter |
Idealisk för att bevara cellytmarkörer; vanligt för immunfenotypning |
Etanol |
70-100 % |
10-15 minuter |
Bäst för DNA-innehållsanalys och cellcykelstudier |
Metanol |
90-100 % |
10-15 minuter |
Lämplig för intracellulär proteinanalys; kan orsaka cellkrympning |
Formalin |
10 % (formaldehyd) |
Varierar (beror på vävnad) |
Används vanligtvis för fixerade vävnadsprover, inte för enskilda celler |
Steg-för-steg-guide för att fixa celler för flödescytometri
Förbereda cellprovet
Före fixering är det viktigt att isolera cellerna från vävnads- eller blodprovet. Centrifugering är den vanligaste metoden som används för att koncentrera celler i en suspension. Det är också viktigt att tvätta cellerna noggrant för att avlägsna eventuella odlingsmedier eller kvarvarande föroreningar som kan störa fixeringsprocessen.
1. Cellisolering: Använd standardisoleringsmetoder som centrifugering eller cellsortering för att separera cellerna av intresse.
2. Tvättning: Tvätta cellerna med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) för att avlägsna rester av media och föroreningar som kan påverka fixeringsprocessen.
Fixeringsförfarande
När cellerna är förberedda är nästa steg att lägga till fixeringsmedlet till cellsuspensionen. Det vanligaste fixeringsmedlet för flödescytometri är en 2-4 % PFA-lösning.
1. Tillsätt fixeringsmedlet till cellsuspensionen och se till att det är väl blandat.
2. Inkubera cellerna med fixeringsmedlet i 15-30 minuter vid 2-8°C.
3. Efter inkubationen, tvätta cellerna två gånger med PBS för att avlägsna överskott av fixativ.
Steg efter fixering
Efter fixering måste cellerna hanteras varsamt. Om ytterligare analys behövs, bör cellerna färgas före analys. Om du planerar att lagra cellerna för framtida analys, återsuspendera dem i en lämplig buffert och förvara dem vid 2-8°C. Undvik att lämna celler i fixeringsmedlet under långa perioder, eftersom överfixering kan leda till ökad autofluorescens och minskad signalkvalitet.
Tips för optimal fixering i flödescytometri
Undviker överfixering
Överfixering uppstår när celler exponeras för fixeringsmedlet för länge, vilket kan resultera i överdriven tvärbindning av cellulära proteiner och äventyra kvaliteten på data. Detta kan leda till autofluorescens, minskad antikroppsbindning och felaktiga flödescytometrimätningar. Kontrollera alltid de rekommenderade fixeringstiderna för din specifika celltyp och experimentera för att undvika överfixering.
Fixeringstid vs. provtyp
Den optimala fixeringstiden kan variera beroende på celltyp och experimentets karaktär. Till exempel kan immunceller kräva kortare fixeringstider än vävnadsprover. Justera fixeringstiden baserat på de specifika behoven för provtypen. För ytproteinanalys räcker vanligtvis en kortare fixeringstid (10-15 minuter). För intracellulär färgning eller DNA-analys kan en längre fixeringstid krävas.
Färgning efter fixering
Efter fixering av cellerna är färgning med antikroppar eller fluorescerande färgämnen ett kritiskt steg i flödescytometrianalys. Vissa fluorescerande färgämnen, särskilt tandemfärger, kan vara känsliga för fixering och kan brytas ned om cellerna är överfixerade. För optimala färgningsresultat rekommenderas det att färga cellerna före fixering när det är möjligt. Detta kan hjälpa till att förhindra färgnedbrytning och säkerställa starkare fluorescenssignaler.
Lagring av fasta celler för flödescytometri
Korttidsförvaring
För korttidsförvaring kan fixerade celler förvaras i kylskåp vid 2-8°C. Detta är idealiskt när du planerar att analysera cellerna inom en eller två dagar efter fixering. Förvara alltid fasta celler i mörker för att förhindra fotoblekning, vilket kan påverka de fluorescerande signalerna.
Långtidsförvaring
För långtidslagring kan celler frysas i kryokonserveringsmedia. Ett typiskt kryokonserveringsmedium består av 10 % dimetylsulfoxid (DMSO) och 90 % fetalt bovint serum (FBS). Men serumfria kryokonserveringslösningar som mFreSR™ eller CryoStor™ CS10 är också tillgängliga och kan användas för att undvika problem associerade med FBS. För att förhindra iskristallbildning, använd en kontrollerad frys för att frysa cellerna. Detta hjälper till att upprätthålla cellviabiliteten och säkerställer korrekt lagring.
Vanliga fallgropar att undvika vid cellfixering för flödescytometri
Effekter av felaktig fixering
Felaktig fixering kan leda till flera problem, inklusive autofluorescens, minskad antikroppsbindning och dålig cellviabilitet. Dessa problem kan avsevärt påverka noggrannheten och tillförlitligheten av flödescytometriresultat. Verifiera alltid fixeringsprotokoll för din specifika provtyp och se till att fixeringsförhållandena är lämpliga för celltypen och markörerna som analyseras.
Att välja rätt fixativ för din applikation
Att välja rätt fixativ för ditt flödescytometriexperiment är avgörande för att få tillförlitliga och korrekta resultat. Olika fixativ är bättre lämpade för olika applikationer. Till exempel används PFA vanligtvis för analys av ytproteiner, medan etanol är idealiskt för DNA-baserade studier. Innan du startar experimentet, undersök det bästa fixeringsmedlet för din specifika applikation och justera fixeringsprotokollet därefter.
Slutsats
Korrekt cellfixering är avgörande för att uppnå framgångsrik flödescytometrianalys. Det hjälper till att bevara cellulära strukturer och säkerställer integriteten hos proteiner och DNA. Genom att följa korrekta fixeringsprotokoll och undvika överfixering kan forskare förbättra datanoggrannheten och tillförlitligheten. Att välja rätt fixativ för ditt experiment förbättrar den övergripande kvaliteten på dina resultat. Genom att implementera dessa bästa metoder säkerställs att din flödescytometrianalys ger konsekventa, reproducerbara insikter om cellulära funktioner.
Korrekt cellfixering spelar en nyckelroll i flödescytometri, och produkter från HKeybio erbjuder pålitliga lösningar. Deras erbjudanden säkerställer resultat av hög kvalitet och är betrodda av forskare över hela världen för noggrann cellanalys.
FAQ
F: Vad är betydelsen av cellfixering i flödescytometri?
S: Cellfixering är avgörande i flödescytometri eftersom det bevarar cellulära strukturer och säkerställer integriteten hos proteiner och DNA för korrekt analys.
F: Hur länge ska celler fixeras för flödescytometri?
S: Celler bör vanligtvis fixeras i 15-30 minuter med en 2-4% paraformaldehyd (PFA) lösning för att bibehålla cellulär integritet.
F: Kan jag använda etanol för cellfixering i flödescytometri?
S: Ja, etanolfixering används ofta för analys av DNA-innehåll i flödescytometri, särskilt för cellcykelstudier.
F: Vad händer om celler är överfixerade i flödescytometri?
S: Överfixering kan orsaka överdriven tvärbindning, vilket leder till autofluorescens och dålig antikroppsbindning, vilket kan påverka flödescytometriresultaten.
