Увод
Да ли сте се икада запитали како проточна цитометрија постиже тако прецизну и поуздану анализу ћелија? Кључ за тачне резултате лежи у правилној фиксацији ћелија. Проточна цитометрија омогућава истраживачима да проучавају различите карактеристике ћелија, од величине до интензитета флуоресценције. Међутим, без одговарајуће фиксације, подаци можда неће одражавати права својства ћелија. У овом чланку ћемо истражити важност фиксације ћелија у проточној цитометрији, разговарати о различитим методама фиксације и поделити савете за оптималне резултате.
Шта је фиксација ћелија у проточној цитометрији?
Дефиниција фиксације ћелије
Фиксација ћелије је процес који стабилизује и чува ћелије спречавањем промена у њиховој структури, функцији и молекуларном саставу. Овај процес се постиже хемијским умрежавањем протеина, липида и других ћелијских компоненти, ефективно „замрзавање“ ћелија у њиховом тренутном стању. Ово је посебно важно у проточној цитометрији јер спречава деградацију ћелијских маркера или промену ћелијских структура током анализе. Фиксирањем ћелија, истраживачи могу осигурати да карактеристике ћелија остану конзистентне, што омогућава прецизна мерења и поуздане податке током анализе проточне цитометрије.
Зашто је фиксација важна
Правилна фиксација је неопходна јер одржава интегритет ћелијских протеина и нуклеинских киселина, који су кључни за прецизну анализу проточне цитометрије. Ако ћелије нису фиксиране, њихова структура и молекуларни маркери могу се временом деградирати или променити, што доводи до непоузданих и нетачних резултата. Фиксација такође игра кључну улогу у стабилизацији ћелија за анализу са више параметара, што је једна од кључних предности проточне цитометрије. Омогућава истраживачима да истовремено процене више карактеристика ћелија, као што су површински маркери, интрацелуларни протеини и садржај ДНК, у једном експерименту. Без одговарајуће фиксације, добијени подаци могу бити недоследни или непотпуни, што доводи до погрешног тумачења експерименталних исхода.
Врсте метода фиксације за проточну цитометрију
Фиксација параформалдехидом (ПФА).
Параформалдехид (ПФА) је један од најчешће коришћених фиксатора у проточној цитометрији, пре свега због своје ефикасности у очувању ћелијске морфологије и антигености. Делује тако што повезује протеине унутар ћелија, обезбеђујући да и ћелијска структура и површински протеини остану нетакнути. Ово чини ПФА одличним избором за очување површинских маркера ћелије, посебно када се анализира експресија површинског протеина у експериментима имунофенотипизације.
Препорука:
● Концентрација: 2-4% ПФА се обично користи за оптималну фиксацију.
● Време фиксације: Ћелије треба инкубирати у ПФА 15-30 минута на 2-8°Ц.
● Чување: Након фиксације, ћелије треба чувати на 2-8°Ц за краткотрајно складиштење. Важно је да не складиштите фиксне ћелије на дужи период, јер то може довести до губитка интегритета маркера.
Важно је избегавати прекомерну фиксацију, пошто продужено излагање ПФА може довести до ћелијске аутофлуоресценције и ометати накнадно бојење и анализу. Увек користите минимално потребно време за фиксацију.
Етханол Фикатион
Фиксација етанолом се обично користи када је фокус анализе на садржају ДНК, као на пример у студијама ћелијског циклуса. Етанол је дехидрирајући агенс који делује тако што продире у ћелијску мембрану и чува ДНК унутар ћелија. Ово чини фиксацију етанолом посебно корисном за анализе засноване на ДНК и анализе проточне цитометрије где се испитују фазе ћелијског циклуса или садржај ДНК.
Препорука:
● Концентрација: Обично се користи 70-100% етанола.
● Време фиксације: Фиксација етанолом обично захтева 10-15 минута за оптималне резултате.
Фиксација етанолом је идеална за очување фаза ћелијског циклуса и може се користити у комбинацији са бојама које везују ДНК као што је пропидијум јодид (ПИ) за анализу ћелијског циклуса.
Метханол Фикатион
Метанол је још један често коришћени фиксатив, посебно за интрацелуларне анализе. Делује тако што продире кроз ћелијску мембрану и стабилизује унутрашње структуре ћелије. Док је метанол ефикасан у очувању ћелијских протеина и антигена, може изазвати скупљање ћелија, што може утицати на тумачење одређених карактеристика, као што су величина и морфологија ћелије.
Препорука:
● Концентрација: Обично се користи 90-100% метанола.
● Време фиксације: обично је довољно 10-15 минута.
Фиксација метанола се често користи када се проучавају интрацелуларни протеини, посебно када се испитују маркери унутар цитоплазме или језгра. Међутим, истраживачи би требало да узму у обзир потенцијал за скупљање ћелија када користе фиксацију метанолом.
Други фиксативи (нпр. Формалин)
Формалин, раствор формалдехида у води, је још један фиксатив који се користи у проточној цитометрији, иако је мање уобичајен од ПФА. Формалин се широко користи у хистологији и имунохистохемији, где ефикасно чува узорке ткива за микроскопску анализу. Иако формалин може да сачува ћелијске структуре, генерално се не препоручује за проточну цитометрију осим ако се не ради са фиксним узорцима ткива, јер може ометати сортирање ћелија и неке примене флуоресценције. Фиксација формалина је најпогоднија за узорке ткива, а не за појединачне ћелије.
Фиксатив |
Концентрација |
Време фиксације |
Препоручена употреба |
параформалдехид (ПФА) |
2-4% |
15-30 минута |
Идеалан за очување маркера ћелијске површине; уобичајено за имунофенотипизацију |
Етанол |
70-100% |
10-15 минута |
Најбоље за анализу садржаја ДНК и студије ћелијског циклуса |
Метанол |
90-100% |
10-15 минута |
Погодно за интрацелуларну анализу протеина; може изазвати скупљање ћелија |
Формалин |
10% (формалдехид) |
Варира (зависи од ткива) |
Обично се користи за фиксне узорке ткива, а не за појединачне ћелије |
Водич корак по корак за фиксирање ћелија за проточну цитометрију
Припрема узорка ћелије
Пре фиксације, неопходно је изоловати ћелије из узорка ткива или крви. Центрифугирање је најчешћи метод који се користи за концентрисање ћелија у суспензији. Такође је од кључног значаја да се ћелије темељно оперу како би се уклонили сви медији за културу или заостали загађивачи, који би могли да ометају процес фиксације.
1. Изолација ћелија: Користите стандардне методе изолације као што су центрифугирање или сортирање ћелија да бисте одвојили ћелије од интереса.
2. Прање: Исперите ћелије физиолошким раствором пуферованим фосфатом (ПБС) да бисте уклонили остатке медијума и загађиваче који би могли да утичу на процес фиксације.
Процедура фиксације
Када су ћелије припремљене, следећи корак је додавање фиксатора у ћелијску суспензију. Најчешће коришћени фиксатив за проточну цитометрију је 2-4% раствор ПФА.
1. Додајте фиксатив у ћелијску суспензију, пазећи да је добро измешана.
2. Инкубирајте ћелије са фиксативом 15-30 минута на 2-8°Ц.
3. После инкубације, опрати ћелије два пута са ПБС-ом да би се уклонио вишак фиксатора.
Кораци након фиксације
Након фиксације, ћелијама се мора пажљиво руковати. Ако је потребна даља анализа, ћелије треба да буду обојене пре анализе. Ако планирате да сачувате ћелије за будућу анализу, ресуспендујте их у одговарајућем пуферу и чувајте на 2-8°Ц. Избегавајте остављање ћелија у фиксатору током дужег периода, јер прекомерна фиксација може довести до повећане аутофлуоресценције и смањеног квалитета сигнала.
Савети за оптималну фиксацију у проточној цитометрији
Избегавање прекомерне фиксације
Прекомерна фиксација се дешава када су ћелије предуго изложене фиксатору, што може довести до прекомерног умрежавања ћелијских протеина и угрозити квалитет података. Ово може довести до аутофлуоресценције, смањеног везивања антитела и нетачних мерења проточне цитометрије. Увек проверите препоручена времена фиксације за ваш специфични тип ћелије и експериментишите да бисте избегли прекомерну фиксацију.
Време фиксације у односу на тип узорка
Оптимално време фиксације може да варира у зависности од типа ћелије и природе експеримента. На пример, имуне ћелије могу захтевати краће време фиксације него узорци ткива. Подесите време фиксације на основу специфичних потреба типа узорка. За анализу површинских протеина обично је довољно краће време фиксације (10-15 минута). За интрацелуларно бојење или анализу ДНК, може бити потребно дуже време фиксације.
Бојење након фиксације
Након фиксирања ћелија, бојење антителима или флуоресцентним бојама је критичан корак у анализи проточне цитометрије. Неке флуоресцентне боје, посебно тандем боје, могу бити осетљиве на фиксацију и могу се деградирати ако су ћелије превише фиксиране. За оптималне резултате бојења, препоручује се бојење ћелија пре фиксације кад год је то могуће. Ово може помоћи да се спречи деградација боје и обезбеди јачи сигнал флуоресценције.
Чување фиксних ћелија за проточну цитометрију
Краткорочно складиштење
За краткотрајно складиштење, фиксне ћелије се могу чувати у фрижидеру на 2-8°Ц. Ово је идеално када планирате да анализирате ћелије у року од дан или два након фиксације. Увек чувајте фиксне ћелије у мраку да бисте спречили фотобељење, које може утицати на флуоресцентне сигнале.
Дугорочно складиштење
За дуготрајно складиштење, ћелије се могу замрзнути у медијумима за криопрезервацију. Типичан медијум за криопрезервацију састоји се од 10% диметил сулфоксида (ДМСО) и 90% феталног говеђег серума (ФБС). Међутим, решења за криопрезервацију без серума као што су мФреСР™ или ЦриоСтор™ ЦС10 су такође доступна и могу се користити за избегавање проблема повезаних са ФБС. Да бисте спречили формирање ледених кристала, користите замрзивач контролисане брзине за замрзавање ћелија. Ово помаже у одржавању виталности ћелија и обезбеђује правилно складиштење.
Уобичајене замке које треба избегавати у фиксацији ћелија за проточну цитометрију
Ефекти неправилне фиксације
Неправилна фиксација може довести до неколико проблема, укључујући аутофлуоресценцију, смањено везивање антитела и лошу одрживост ћелија. Ови проблеми могу значајно утицати на тачност и поузданост резултата проточне цитометрије. Увек проверите протоколе фиксације за ваш специфични тип узорка и уверите се да су услови фиксације одговарајући за тип ћелије и маркере који се анализирају.
Одабир правог фиксатора за вашу апликацију
Одабир одговарајућег фиксатора за ваш експеримент проточне цитометрије је кључан за добијање поузданих и тачних резултата. Различити фиксативи су погоднији за различите примене. На пример, ПФА се обично користи за анализу површинских протеина, док је етанол идеалан за студије засноване на ДНК. Пре него што започнете експеримент, истражите најбољи фиксатив за вашу специфичну примену и прилагодите протокол фиксације у складу са тим.
Закључак
Правилна фиксација ћелија је неопходна за постизање успешне анализе проточне цитометрије. Помаже у очувању ћелијских структура и осигурава интегритет протеина и ДНК. Праћењем одговарајућих протокола фиксирања и избегавањем прекомерне фиксације, истраживачи могу да побољшају тачност и поузданост података. Избор одговарајућег фиксатора за ваш експеримент побољшава укупан квалитет ваших резултата. Примена ових најбољих пракси осигурава да ваша анализа проточне цитометрије пружа конзистентан, поновљив увид у ћелијске функције.
Правилна фиксација ћелија игра кључну улогу у проточној цитометрији и производима из ХКеибио нуди поуздана решења. Њихова понуда обезбеђује висококвалитетне резултате и поверење истраживача широм света за тачне анализе ћелија.
ФАК
П: Која је важност фиксације ћелија у проточној цитометрији?
О: Фиксација ћелије је кључна у проточној цитометрији јер чува ћелијске структуре и обезбеђује интегритет протеина и ДНК за тачну анализу.
П: Колико дуго ћелије треба да буду фиксиране за проточну цитометрију?
О: Ћелије обично треба фиксирати 15-30 минута са 2-4% раствором параформалдехида (ПФА) да би се одржао ћелијски интегритет.
П: Могу ли да користим етанол за фиксацију ћелија у проточној цитометрији?
О: Да, фиксација етанолом се обично користи за анализу садржаја ДНК у проточној цитометрији, посебно за студије ћелијског циклуса.
П: Шта се дешава ако су ћелије превише фиксиране у проточној цитометрији?
О: Прекомерна фиксација може изазвати прекомерно умрежавање, што доводи до аутофлуоресценције и лошег везивања антитела, што може утицати на резултате проточне цитометрије.
